Produção de proteínas heterólogas em microalga

Resumo

Microalgas são um sistema atrativo para expressão de proteínas recombinantes por sua
facilidade de produção em larga escala e baixo custo de cultivo.
Microalgas quando usadas em estratégias de secreção de proteínas alvo são especialmente
interessantes pois o processo de secreção permite:
● separar e purificar a proteína alvo de uma matriz simples, impactando custo e
qualidade;
● cultivar as células com perfusão, aumentando produtividade e reduzindo tamanho de
unidades de processamento;
● usar certos maquinários moleculares para modificações pós-traducionais, como
glicosilação.
Apesar de todas as vantagens listadas, nós identificamos pelo menos duas lacunas
relacionadas ao desenvolvimento dessa plataforma de expressão:
(1) estudos com peptídeo sinal (PS) são escassos, não permitindo escolha de PS com
maior eficiência de secreção e normalmente obtêm baixos rendimentos
(2) fotobiorreatores de escala laboratorial comerciais, não permitem paralelização de
experimentos por seu custo proibitivo, reduzindo velocidade de desenvolvimento
Para reduzir essas lacunas o trabalho foi organizado em duas partes:
● melhoramento das ferramentas moleculares, com avaliação de 7 proteínas
fluorescentes (PF) como repórteres de secreção em Chlamydomonas reinhardtii e
avaliação de 10 PSs,
● desenvolvimento de equipamentos de baixo custo para cultivo de microalgas
recombinantes
Realizado de forma a permitir comparação direta entre os PSs e cultivo da cepa recombinante
em condições de alta produtividade (fotobiorreator), o trabalho objetivou obter alto rendimento
de secreção pelas cepas recombinantes.
Apesar do sucesso na secreção das 7 proteínas fluorescentes (ciano: mCerulean; verde: GFP
e Emerald; laranja: cOFP, tdTomato; e vermelho mCherry), a eficiência de cada PF como
repórter foi influenciada por sua região de fotoatividade. Os resultados sugerem que na região
do laranja e vermelho há uma menor interferência pelos pigmentos celulares, já que elevadas
relações sinal ruído (SN = 7,7 - 16,0) foram obtidas nessa região. Além disso, essas PFs
apresentaram alta frequência de colônias positivas (>75%), com exceção da tdTomato (<9%).
A mCherry foi escolhida para ser fusionada aos PSs selecionados para o estudo, 4 obtidos na
literatura ( binding protein 1 – BiP1; arilsulfatase 1 – ARS1, anidrase carbônica 1 – CAH1], e
ice-binding protein 1 – IBP1) e 6 de 2221 novos PSs previstos pelo software SignalP 4.0. Os
peptídeos sinais com maior eficiência de secreção foram PS 5 e 7, ambos novos, com
aumento de pelo menos 25% na capacidade de secreção de mCherry frente ao melhor
peptídeo dos descritos na literatura (ARS1). Para estender a avaliação, o peptídeo sinal PS 5foi utilizado para secretar hialuronidase, um biofármaco, obtendo colônias com atividade
hialuronidásica no sobrenadante.
Na última parte do trabalho, foi desenvolvido o fotobiorreator tubular fechado, para cultivo dos
organismos geneticamente modificados, que alcançou produtividade de 10 mg/L.d de
mCherry, com velocidade máxima de crescimento de 1,27 d -1 , a uma fração dos custo das
alternativas comerciais.
Os resultados e recursos gerados nesse trabalho, fomentarão o desenvolvimento de
bioprocessos para a produção de proteínas por microalgas recombinantes, por identificar
peptídeos sinais mais eficientes, identificar as PFs úteis como repórteres e demonstrar a
viabilidade da construção de fotobiorreatores esterilizáveis em escala laboratorial.

PRODUÇÃO INTELECTUAL
Artigos publicados em periódicos

Molino JVD , de Carvalho JCM, Mayfield S. Evaluation of secretion reporters to microalgae
biotechnology: blue to red fluorescent proteins. Algal Research. 2018. 31: 252–261.
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Molino JVD, de Carvalho JCM, Mayfield S. Comparison of secretory signal peptides for
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Chlamydomonas reinhardtii . PLoS ONE. 2018. 13(2): e0192433. https://doi.org/10.1371/
Molino JVD , et al. Chimeric spider silk production in microalgae: a modular bionanomaterial.
Research Ideas and Outcomes 2. 2016. e9342 DOI 10.3897/rio.2.e9342

Trabalhos publicados em anais de eventos (completo)
Molino JVD , et al. Construção de uma Centrífuga e de um Sistema de Eletroforese de baixo
custo: Fabricação Digital como alternativa para a Educação. 1 a . Conferência FabLearn Brasil,
2016, São Paulo.

Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo)
Molino, JVD , et al. AlgAranha. International Genetically Engineered Machine - iGEM - 2016,
Boston.
Molino JVD , Rasala B, Mayfield S, de Carvalho JCM. Signal Peptides development for Algae.
Food & Fuel for the 21st Century Symposium, 2015, San Diego.

Produtos tecnológicos
Molino JVD . Cisluminator for agarose gel. Zenodo. 2017, São Paulo. Zenodo
http://doi.org/10.5281/zenodo.494977
Molino JVD , Diaz CA, Camargo, LSF, Tanaka, AE, & Carvalho, JCM. Tubular Photobioreactor
- For microalgae. 2017, São Paulo. Zenodo. http://doi.org/10.5281/zenodo.495196
Molino JVD , & de Carvalho, JCM. LED Panel - microalgae. 2017 Zenodo.
http://doi.org/10.5281/zenodo.495204
Molino JVD , & Vieira, D. OpenCyclop - a in situ microscope. 2017. São Paulo Zenodo
http://doi.org/10.5281/zenodo.495192
Molino JVD & Arico B, et al. Microcentrifuga - Centrífuga Seletora
https://github.com/Brunoarico/centrifuge

Demais produções técnicas
Banco de dados
Molino JVD , Carvalho JCM, & Mayfield S. In silico identified signal peptides of
Chlamydomonas reinhardtii [Data set]. 2017. Zenodo. http://doi.org/10.5281/zenodo.556792

Educação e Popularização de C & T
Molino JVD, Apresentação da tese de doutorado. Vídeo. 2017.
https://youtu.be/4DQDCijnwoQ
Molino JVD , Possibly mating algae - Chlamydomonas reinhardtii. Vídeo. 2017.
https://www.youtube.com/watch?v=aNZfJbw9hB4
Molino JVD , Swimming algae - Chlamydomonas reinhardtii. Vídeo. 2017.
https://www.youtube.com/watch?v=YZDDe_sQGH8
Molino JVD , Como calcular quantidade de proteínas com o ImageJ. Vídeo. 2017.
https://www.youtube.com/watch?v=NJO0CLwwpmw

Molino JVD , Como planejar a expressão de uma proteína. Vídeo. 2017.
https://www.youtube.com/watch?v=xvvWs9vQtk4
Molino JVD , Técnica de esterilização - Autoclavação. Vídeo. 2017.
https://www.youtube.com/watch?v=6Vt5IfaPbbQ
Molino JVD , Mendeley Referencias. Vídeo. 2017.
https://www.youtube.com/watch?v=_IDL0_lVkRg
Molino JVD , Enzimas - Cinética Enzimática. Vídeo. 2016
https://www.youtube.com/watch?v=rzySA3FWB7g
Molino JVD , Imobilização de Enzimas. Vídeo. 2016.
https://www.youtube.com/watch?v=YXHhEFSsH7g
Molino JVD , Enzimas - Intro. Vídeo. 2016. https://www.youtube.com/watch?v=W0-iatnGm8A
Molino JVD, Processo Contínuo. Vídeo. 2016.
https://www.youtube.com/watch?v=Y_pZwXHyPnI
Molino JVD , Velocidade Específica de Crescimento e Fator de Conversão. Vídeo. 2016
https://www.youtube.com/watch?v=TZWrCfB11tY
Molino JVD , Como desenhar primers para USER. Vídeo. 2016.
https://www.youtube.com/watch?v=PeM66bcTGQo
Molino JVD , Fermentação alcoólica industrial. Vídeo. 2016.
https://www.youtube.com/watch?v=cEhzNRC6IfI