Journal article Open Access

Pre-PCR Processing, PCR Facilitators and Stabilizer Additives

Tekin, Kemal; Kocaman, Mustafa

Özet

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) temelli testler günümüzde enfeksiyon hastalıklarının tanı ve izleminde en sık kullanılan moleküler yöntemlerdir. PCR’ın farklı amaçlar için tasarlanmış nested PCR, ters transkripsiyon PCR, multipleks PCR, real-time PCR ve kantitatif PCR gibi çok sayıda farklı modifikasyonu geliştirilmiştir. Real-time PCR’ın bile birbirinden farklı görüntüleme yöntemleri ve prob tasarımlarının kullanıldığı çok sayıda alt tipi vardır. PCR yöntemi bu modifikasyonları dışında yeni nesil dizi analizi, DNA çip teknolojisi, ters hibridizasyon teknikleri, klonlama çalışmaları, lumineks teknolojisi, PCR-ELISA ve PCR-RFLP gibi temel moleküler tekniklerin bir parçası veya ön basamağı olarak da yaygın kullanım alanı bulmuştur. Bu önemli teknik çevresel, klinik, fosil, adli tıp, gıda, bitki, su ve in-vitro ortam örneklerinde başlıca DNA veya RNA varlığını saptamayı ve analiz etmeyi hedefler. Bu örneklerin bazıları PCR üzerine değişen derecelerde inhibitör etkiler gösteren çok sayıda kompleks biyolojik molekül içeren karışımlardır. Bu heterojen karışımlar içerisinde bulunan inhibitör maddelerin ve ayrıca DNA ve RNA yapısını bozabilen enzimlerin uzaklaştırılması önemlidir. Nükleik asit eldesi için bazı durumlarda hücre duvarı yapılarını parçalamak veya bu moleküllere bağlı proteinleri uzaklaştırmak gerekirken, tüm işlemleri DNA ve RNA bütünlüğünü bozmadan yapmak önemlidir. Yetersiz nükleik asit ekstraksiyonu veya inhibitör maddelerin varlığı özellikle az sayıda hedef nükleik asit içeren örneklerde yanlış negatif sonuçlara neden olabilen önemli bir problemdir. Günümüzde DNA ve RNA eldesi için çok sayıda farklı ekstraksiyon ve saflaştırma yöntemi tanımlanmış ve bu yöntemlerin farklı kombinasyonları otomatize sistemlere entegre edilmiştir. PCR reaksiyonunun verimliliğini artırmanın alternatif bir yolu ise reaksiyon karışımına amplifikasyon kolaylaştırıcıları veya PCR güçlendiricileri olarak adlandırılan stabilizatör katkıların eklenmesidir. PCR temelli yeni bir protokol tasarlanırken veya yeni geliştirilen PCR temelli bir teknikte farklı moleküller kullanılırken ortaya çıkabilecek bilinmeyen yeni inhibitör etkileri izleyerek PCR öncesi koşulların ve amplifikasyon sürecinin optimize edilmesi önem arz etmektedir. Bu makalede her biri farklı avantaj ve dezavantajlara sahip PCR öncesi hazırlık işlemlerinin ve yaygın kullanılan amplifikasyon kolaylaştırıcılarının genel özelliklerinin bir özeti sunulmuştur.

Abstract

Polymerase Chain Reaction (PCR) based tests are the most commonly used molecular methods in the diagnosis and monitoring of infectious diseases today. Numerous different modifications of PCR have been developed and designed for different purposes, such as nested PCR, reverse transcription PCR, multiplex PCR, real-time PCR and quantitative PCR. Even real-time PCR has many types using various imaging methods and different probe designs. Apart from these modifications, the PCR method is also widely used as a part or a preliminary step of basic molecular techniques such as next-generation sequence analysis, DNA chip technology, reverse hybridization techniques, cloning studies, luminex technology, PCR-ELISA and PCR-RFLP. This important technique aims to detect and analyze the presence of DNA or RNA in environmental, clinical, fossil, forensic, food, plant, water and in-vitro media samples. Some of these samples are mixtures containing many complex biological molecules with varying degrees of inhibitory effects on PCR. It is important to remove inhibitory substances in these heterogeneous mixtures as well as enzymes that can disrupt DNA and RNA structure. In order to obtain nucleic acids, in some cases, it is necessary to break down cell wall structures or remove the proteins tightly bound to these molecules and it is important to carry out all these processes without disrupting the integrity of DNA and RNA. Insufficient nucleic acid extraction or the presence of inhibitory agents are important problems that can cause false negative results, especially in samples containing a small number of target nucleic acids. Today, many different extraction and purification methods have been defined for DNA and RNA extraction and different combinations of these methods have been integrated into automated systems. An alternative way to increase the efficiency of the PCR reaction is to add stabilizer additives called amplification facilitators or PCR enhancers to the reaction mixture. It is important to optimize the pre-PCR conditions and amplification process by observing unknown inhibitory effects that may occur when designing a new PCR protocol or using different molecules in a newly developed PCR-based technique. This article provides a summary of the pre-PCR preparation processes, each with different advantages and disadvantages, and the general features of commonly used amplification facilitators.

PCR Öncesi Hazırlık, PCR Kolaylaştırıcıları ve Dengeleyici Katkılar
Files (271.9 kB)
Name Size
9.JMVI-2020-1.2;11-18.pdf
md5:eea05e88e92f412b086c2abd046915b4
271.9 kB Download
  • 1. Rådström P, Knutsson R, Wolffs P, Dahlenborg M, Löfström C. Pre-PCR Processing of Samples. In: Sachse K, Frey J (eds), PCR Detection of Microbial Pathogens: Methods and Protocols. 2003, Humana Press Inc, Totowa, NJ, USA. pp:31-50.

  • 2. Lübeck PS, Hoorfar J. PCR Technology and Applications to Zoonotic Food-Borne Bacterial Pathogens. In: Sachse K, Frey J (eds), PCR Detection of Microbial Pathogens: Methods and Protocols. 2003, Humana Press Inc, Totowa, NJ, USA. pp:65-86.

  • 3. Yu F, Qiu T, Zeng Y, Wang Y, Zheng S, Chen X, et al. Comparative Evaluation of Three Preprocessing Methods for Extraction and Detection of Influenza A Virus Nucleic Acids from Sputum. Front Med (Lausanne) 2018; 5: 56.

  • 4. Rådström P, Knutsson R, Wolffs P, Lövenklev M, Löfström C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol 2004; 26(2): 133-46.

  • 5. Abu Al-Soud W, Rådström P. Effects of amplification facilitators on diagnostic PCR in the presence of blood, feces, and meat. J Clin Microbiol 2000; 38(12): 4463-70.

  • 6. Dalla-Costa LM, Morello LG, Conte D, Pereira LA, Palmeiro JK, Ambrosio A, et al. Comparison of DNA extraction methods used to detect bacterial and yeast DNA from spiked whole blood by real-time PCR. J Microbiol Methods. 2017; 140: 61-6.

  • 7. Kapp JR, Diss T, Spicer J, Gandy M, Schrijver I, Jennings LJ, et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol 2015; 68(2): 111-8.

  • 8. Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS-mechanisms and solutions. Anal Bioanal Chem 2020; 412(9): 2009-23.

  • 9. Kumar G, Eble JE, Gaither MR. A practical guide to sample preservation and pre-PCR processing of aquatic environmental DNA. Mol Ecol Resour 2020; 20(1): 29-39.

  • 10. Zhou Y, Zhang Y, He W, Wang J, Peng F, Huang L, et al. Rapid Regeneration and Reuse of Silica Columns from PCR Purification and Gel Extraction Kits. Sci Rep 2018; 8(1): 12870.

  • 11. Rådström P, Lövenklev M, Wolffs P, Löfström C, Knutsson R. Pre-PCR processing strategies. In: Weissensteiner T, Griffin HG, Griffin AM (eds), PCR Technology: Current Innovations. 2003, 2nd, CRC/Taylor & Francis, New York. pp:37-45.

  • 12. Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA. Phenol: Product Information. Available at: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/Product_Information_Sheet/p3653pis.pdf [Accessed May 22, 2020].

  • 13. Lantz PG, Matsson M, Wadström T, Radström P. Removal of PCR inhibitors from human faecal samples through the use of an aqueous twophase system for sample preparation prior to PCR. J Microbiol Methods 1997; 28(3): 159-67.

  • 14. Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA. RNA Rapid Extraction Solution. Available at: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9775#/AM9775 [Accessed June 18, 2020].

  • 15. van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP. Deoxynucleotide Triphosphates and Buffer Components (Chapter 6). In: van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (eds), Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. 2008, Springer, New York. pp:91-102.

  • 16. Al-Soud WA, Rådström P. Capacity of nine thermostable DNA polymerases To mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples. Appl Environ Microbiol 1998; 64(10): 3748-53.

  • 17. Henke W, Herdel K, Jung K, Schnorr D, Loening SA. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res 1997; 25(19): 3957-8.

  • 18. Hedman J, Rådström P. Overcoming inhibition in real-time diagnostic PCR. Methods Mol Biol 2013; 943: 17-48.

  • 19. van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP. The PCR in Practice (Chapter 3). In: van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (eds), Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. 2008, Springer, New York. pp:17-24.

39
42
views
downloads
Views 39
Downloads 42
Data volume 11.4 MB
Unique views 37
Unique downloads 41

Share

Cite as