Basic Principles of Polymerase Chain Reaction Technology

Özet

Kary Mullis’in 1984 yılında bulduğu ve kendisine Nobel ödülü kazandıran polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik DNA sekanslarının in-vitro DNA sentezi yoluyla eksponensiyel (üstel) olarak çoğaltılabildiği hızlı ve duyarlılığı yüksek bir tekniktir. PCR temel olarak bir DNA çoğaltma yöntemidir, bu yöntemle RNA çoğaltılmak istenirse önce "revers transkriptaz" enzimi kullanılarak hedef RNA sekanslarının DNA kopyaları (komplementer DNA, cDNA) çıkartılır ve PCR ile bu cDNA molekülleri çoğaltılır. PCR'ın kullanılmasıyla belirli bir genetik segmentin, birkaç kalıp DNA molekülünden başlayarak milyonlarca kopyası üretilebilmektedir. Kromozomal DNA'nın in-vivo replikasyonu milyonlarca nükleotidin replikasyonunu kapsar, PCR amplifikasyon ürünleri ise genellikle 1000 bp'den (baz çifti, base pair; bp) daha kısa olacak şekilde dizayn edilir. Bununla beraber ekstrem durumlarda özel termostabil DNA bağımlı DNA polimeraz kombinasyonları kullanılarak 35000 bp'den daha uzun PCR amplikonlarının başarılı olarak çoğaltılabildiği bildirilmiştir. Günümüzde bu yöntemin çeşitli varyasyonları mikrobiyoloji, adli tıp ve genetik bilimlerinde araştırma ve tanı amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır. PCR temelli yöntemlerin önemli kullanım alanları arasında dizi analizi, klonlama, kantitatif hasta izlemi, moleküler ilaç direnç testleri, filogenetik analizler ve salgın yönetimi ve doku uyumluluk testleri gibi uygulamalar yer alır. Bu makalede PCR yönteminin temel prensipleri ele alınmıştır.

Abstract

The polymerase chain reaction (PCR) discovered by Kary Mullis in 1984, which earned him the Nobel prize, is a fast and highly sensitive technique in which specific DNA sequences can be exponentially amplified via in-vitro DNA synthesis. PCR is basically a DNA amplification method, if it is desired to reproduce RNA; DNA copies (complementary DNA, cDNA) of the target RNA sequences are firstly produced by using the enzyme "reverse transcriptase" and these cDNA molecules are amplified by PCR. Using PCR, millions of copies of a specific genetic segment can be produced, starting with several target DNA molecules. In-vivo replication of chromosomal DNA involves replication of millions of nucleotides, while PCR amplification products are generally designed to be less than 1000 bp (base pair; bp). However, in extreme cases it has been reported that PCR amplicons longer than 35000 bp can be successfully amplified using special thermostable DNA-dependent DNA polymerase combinations. Today, various variations of this method are widely used in microbiology, forensics and genetics for research and diagnosis purposes. Important uses of PCR based methods include sequence analysis, cloning, quantitative patient monitoring, molecular drug resistance tests, phylogenetic analysis, and epidemic management and tissue compatibility tests. In this article, basic principles of PCR method are discussed.