ПОВЫШЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ ИНАКТИВИРОВАННОГО ВИРУСА ГРИППА А/КАЛИФОРНИЯ/7/09 (H1N1) ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТА ФУКОИДАНА ИЗ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ FUCUS EVANESCENS

Вирус пандемического гриппа А(H1N1) pdm09 циркулирует среди населения и входит в состав современных трех- и четырехвалентных противогриппозных вакцин в качестве одного из компонентов [1, 2]. В составе инактивированных гриппозных вакцин в настоящее время  используются адъюванты на основе алюминия, сквалена (MF59, AS03) или полиоксидоний  [3]. Однако, несмотря на высокую эффективность вакцин, применяемые адъюванты имеют ряд принципиальных недостатков, а также вызывают развитие побочных эффектов. Так, при клинической апробации вакцин из штаммов вируса гриппа А, содержащего AS03 либо MF59 в качестве адъюванта, наблюдалась высокая реактогенность у детей и взрослых, проявляющаяся в виде местных и системных реакций на вакцинацию [4, 5].

В качестве адъювантов активно исследуются соединения полисахаридной (ПС) природы, обладающие высокой биосовместимостью, низкой токсичностью, безопасностью и хорошей переносимостью макроорганизмом.

Цель работы – изучение влияния сульфатированного ПС из бурой водоросли Fucus evanescens на иммунный ответ к инактивированному вирусу гриппа A/California/7/09 H1N1pdm.

Материалы и методы. Исследования выполнены на мышах-самцах BALB/c массой 18–20 г, полученных из питомника ГУ научный центр биомедицинских технологий РАМН «Столбовая».  Работа проводилась с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по за­щите позвоночных животных для эксперименталь­ных работ (Strasbourg, 18.03.1986). Животных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза.

В качестве адъювантов использовали сульфатированный ПС (фукоидан) из бурой водоросли Fucus evanescens и гель гидроокиси алюминия (гидроксид алюминия) (Brenntag Biosector, Дания). Фукоидан представляет собой нативный фукоидан в комплексе с полифенолами и имеет молекулярную массу в диапазоне 130–430 кДа [6].

Мышей BALB/c иммунизировали внутримышечно инактивированным вирусом пандемического гриппа A/California/7/09 H1N1pdm – экспериментальным аналогом вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины в дозах 5 и 15 мкг/мышь с фукоиданом в дозе 200 мкг или гидроксидом алюминия в дозе 500 мг одно- и двукратно с двухнедельным интервалом. Контрольным животным вводили фосфатно-буферный раствор рН 7,2. Животных рандомизировали на группы по 5 мышей в каждой: 1-ая группа – вирус гриппа  5 мкг/мышь с фукоиданом; 2-ая группа – вирус гриппа  15 мкг/мышь с фукоиданом; 3-я группа – вирус гриппа 5 мкг/мышь с гидроксидом алюминия; 4-ая группа – вирус гриппа  15 мкг/мышь с гидроксидом алюминия; 5-ая группа – вирус гриппа  5 мкг/мышь; 6-ая группа – вирус гриппа  15 мкг/мышь; 7-ая группа – фосфатно-буферный раствор.

Оценивали уровень антител  через 2 недели после одно- и двукратной иммунизации. Определение гемагглютинирующих антител к вирусу  гриппа A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 в сыворотке иммунизированных животных  проводилось в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 1,0% куриными эритроцитами.  Результаты реакции учитывали  после оседания эритроцитов в контрольных лунках планшета (через 30–40 мин). Титром сыворотки считали ее наибольшее разведение, при котором наблюдается полное торможение агглютинации эритроцитов в результате взаимодействия вируса со специфическими антителами. Рассчитывали среднее геометрическое титров антител (СГТ).

Результаты исследований подвергали статистической обработке с использованием пакета программы «Statistica-7». Значимость различий оценивали с использованием  критерия достоверности Стьюдента (t), критическое значение уровня значимости принималось равным 5%  (р<0,05).

Результаты и обсуждение. В результате однократной иммунизации мышей вирусом гриппа A/California/7/09 H1N1pdm  в обеих испытуемых дозах в сочетании с фукоиданом (1-ая и 2-ая группы) СГТ антител в сыворотке крови были значимо выше по сравнению с группой животных, иммунизированных    вирусом гриппа А в соответствующих дозах без адъюванта (5-ая и 6-ая группы) (р<0,01). При иммунизации вирусом гриппа в дозе 15 мкг/мышь с гидроксидом алюминия (4-ая группа) СГТ антител не отличалась от соответствующего контроля (6-ая группа) (р>0,05). Стимулирующее влияние фукоидана на антителообразование превосходило эффект гидроксида алюминия (различия в СГТ антител в группах 2 и 4 статистически значимы, р<0,05). После повторной иммунизации фукоидан оказывал 10–27-кратный адъювантный эффект, стимулируя формирование антител к вирусу гриппа A. При этом фукоидан также активнее стимулировал антителообразование по сравнению с гидроксидом алюминия, хотя значимых различий в эффектах этих адъювантов не выявлено (р>0,05) (рис.).

Рис.

Анализ адъювантного эффекта фукоидана в зависимости от вводимой дозы вируса гриппа свидетельствует, что при однократной иммунизации животных инактивированным вирусом гриппа в дозе 15 мкг/мышь СГТ в РПГА составила 640 (320–1280),   а при снижении дозы в 3 раза (5 мкг/мышь) – 278,6 (160–1280) при отсутствии статистически значимых различий между этими показателями (р>0,05). При двукратной иммунизации вирусом гриппа в дозе 15 мкг/мышь СГТ значительно возрастала по сравнению с однократной и составила 1940,1 (640–5120), а в дозе 5 мкг/мышь – 1470,3 (1280–2560) (р>0,05) (рис.).  Отсутствие статистически значимых различий в СГТ в ответ на введение большей и меньшей испытуемых доз свидетельствует о возможности использования более низкой вакцинирующей дозы вируса.

Многочисленные экспериментальные данные  свидетельствуют об адъювантных свойствах фукоиданов в отношении различных антигенов и вакцинных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, в т.ч. гриппа [7, 8]. Результаты наших исследований также свидетельствуют об адъювантной активности фукоидана из бурой водоросли F. evanescens, который проявлялся в повышении иммуногенности инактивированного вируса гриппа А.  

Эффект фукоидана был выражен в большей степени по сравнению с традиционным лицензированным адъювантом гидроксидом алюминия.  При повторной иммунизации фукоидан оказывал значительный адъювантный эффект, стимулируя формирование антител к вирусу гриппа A, а в ответ на введение более низкой дозы вируса СГТ не различались по сравнению с введением высокой дозы. Это важно для выбора вакцинирующей дозы в пользу снижения антигенной нагрузки, что обеспечивает безопасность вакцинации. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования фукоидана в качестве адъюванта в составе противогриппозных вакцин.

Выводы: добавление фукоидана из бурой водоросли F. evanescens к инактивированному вирусу гриппа A/California/7/09 H1N1pdm09 повышает его иммуногенность в 10–27 раз, что свидетельствует о перспективности использования фукоидана в качестве адъюванта в составе противогриппозных вакцин.