ULTRALOW COVERAGE SEQUENCING IS THE MOST ACCURATE LIBRARY QUANTIFICATION METHOD PRIOR TO EXOME SEQUENCING

Accurate DNA library quantification is very important in post-pooling captured exome sequencing. Underrepresented libraries will need additional sequencing which takes extra time and money whereas overexpressed DNA libraries can lead to the generation of more data than required which leads to the waste of sequence capacity and a reduced number of samples per batch. There is a number of methods available to quantify DNA libraries prior to sequencings such as UV absorption use of intercalating dyes capillary electrophoresis 5'-hydrolysis probes (TaqMan^©) coupled with quantitative PCR (qPCR) or droplet digital PCR. But there is no gold standard for the quantification of DNA libraries. This study compares common library quantification methods including LabChip (PerkinElmer Inc. MA USA) Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific MA USA) several qPCR approaches and ultralow coverage sequencing on Illumina MiSeq platform (with and without insert size correction). DNA libraries were prepared using the NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs MA USA). To compare the above-mentioned approaches cost time and quantification accuracy were assessed in our study. Quantification methods involving the use of Qubit and MiSeq were found to be better than qPCR and LabChip approaches at predicting the final library concentration. It was also revealed that MiSeq with insert size correction was the most accurate method for library quantification prior to exome sequencing. This method allows for correction shifts in the ratio due to enrichment. Ultralow coverage sequencing on the Illumina MiSeq platform is the most accurate method of library quantification prior to pooling and post-pooling exome enrichment. --- Resumo --- A quantificação precisa da biblioteca de DNA é muito importante no pós-agrupamento do seqüenciamento do exoma capturado. Bibliotecas sub-representadas precisarão de sequenciamento adicional, o que demanda mais tempo e dinheiro, enquanto bibliotecas de DNA superexpressas podem levar à geração de mais dados do que o necessário, o que leva ao desperdício de capacidade de sequência e um número reduzido de amostras por lote. Existe uma ampla quantidade de métodos disponíveis para quantificar as bibliotecas de DNA antes dos sequenciamentos, tais como absorção de UV, uso de corantes intercalantes, eletroforese capilar, sondas de hidrólise 5´ (TaqMan^©) acopladas com PCR quantitativo (qPCR) ou PCR digital por gota. Mas não há o padrão ouro para a quantificação de bibliotecas de DNA. Este estudo compara métodos comuns de quantificação de bibliotecas, incluindo LabChip (PerkinElmer Inc., MA, EUA), Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA), várias abordagens qPCR e sequenciamento de cobertura ultralow na Illumina MiSeqplatform (com e sem correção de tamanho de inserção ). As bibliotecas de ADN foram preparadas utilizando o Kit NEBNext Ultra DNA Library Prep para Illumina (New England Biolabs, MA, EUA). Para comparar as abordagens acima mencionadas, o custo, o tempo e a precisão da quantificação foram avaliados em nosso estudo. Os métodos de quantificação envolvendo o uso de Qubit e MiSeq foram melhores do que as abordagens qPCR e LabChip na previsão da concentração final da biblioteca. Também foi revelado que o MiSeq com correção do tamanho da inserção foi o método mais preciso para quantificação de bibliotecas antes do sequenciamento do exoma. Este método permite mudanças de correção na razão devido ao enriquecimento. O sequenciamento de cobertura Ultralow na plataforma Illumina MiSeq é o método mais preciso de quantificação de bibliotecas antes do pooling e post-pooling do enriquecimento do exoma.