Diseño de un plásmido capaz de expresar la β-fructosidasa (invertasa) en una biofábrica de origen bacteriano

RESUMEN

La tecnología del ADN recombinante ha permitido desarrollar la capacidad de clonar y expresar en un hospedero un gen ajeno a él, con la finalidad de aumentar la producción de proteínas recombinantes a un menor costo. En los últimos años, las aplicaciones de las enzimas tipo invertasas han sido exploradas en el sector farmacéutico, alimentario e incluso, agropecuario, debido a su capacidad de catalizar la hidrólisis de sacarosa para la síntesis de oligosacáridos. En la presente investigación se diseñó un plásmido capaz de expresar β-fructosidasa (BfrA) del microorganismo extremófilo Thermotoga marítima, proponiendo a Escherichia coli M15 como biofábrica para la expresión y producción de BfrA en la industria de fructooligosacáridos. El diseño del vector consideró la necesidad de una resistencia a antibióticos para las células transformadas, proponiendo el uso de cloranfenicol y ampicilina. Así como la inclusión de una cola de histidinas, que facilite la purificación de la proteína BfrA sintetizada por E. coli M15 mediante cromatografía de afinidad con un metal inmovilizado (IMAC). El vector seleccionado tiene un sitio de clonación múltiple para facilitar la ligación del gen bfrA y el gen reportero gfp como indicador del éxito de la ligación y la síntesis in vivo de la proteína BfrA. El plásmido propuesto ofrece la ventaja de tener una inducción controlada por lactosa pudiendo ser expresado en una bacteria de fácil y rápido crecimiento, lo que representará un menor costo en la síntesis de BfrA a nivel industrial, teniendo la oportunidad de aprovechar al máximo su uso en la producción, por ejemplo, de jarabes de azúcar con alto contenido de fructosa y fructoligosacáridos con propiedades medicinales para personas con diabetes.

ABSTRACT

Recombinant DNA technology has allowed to clone and express a foreign gene in a host to increase the production of recombinant proteins at a lower cost. In recent years, the applications of invertase-type enzymes have been explored in the pharmaceutical, food and even agricultural sectors due to their capacity to catalyze the hydrolysis of sucrose for the synthesis of oligosaccharides. In this research, a plasmid capable of expressing β-fructosidase (BfrA) of the marine extremophile microorganism Thermotoga was designed, proposing Escherichia coli M15 as a biofactory for the expression and production of BfrA in the fructooligosaccharide industry. Vector design considered the need for antibiotic resistance for transformed cells, proposing the use of chloramphenicol and ampicillin. As well as the inclusion of a histidine tail, which facilitates the purification of the BfrA protein synthesized by E. coli M15 by affinity chromatography with an immobilized metal (IMAC). The selected vector has a multiple cloning site to facilitate the ligation of the bfrA gene and the gfp reporter gene as an indicator of successful ligation and in vivo synthesis of BfrA protein. The proposed plasmid offers the advantage of having a lactose-controlled induction and can be expressed in an easy and fast-growing bacterium, which will represent a lower cost in the synthesis of BfrA at an industrial level, having the opportunity to make the most of its use in the production, for example, of high fructose and fructoligosaccharide sugar syrups with medicinal properties for people with diabetes.