L'action de Wolfenstein: The New Order se déroule en Europe dans les années 1960, dans un univers uchronique où les Nazis ont remporté la Seconde Guerre mondiale et conquis le monde entier. Le joueur incarne un ancien soldat américain nommé William « B.J. » Blazkowicz qui, avec le soutien d'un groupe de résistants, se donne pour mission de renverser le régime nazi.
L'univers prend place dans une uchronie d'un monde parallèle où l'Allemagne Nazie a gagné la Seconde Guerre mondiale.
Le Da'at Yichud est une société secrète très ancienne qui développe sans cesse de nouvelles technologies et ce depuis des siècles, au point où leur technologie dépasse celle de l'époque contemporaine de plusieurs centaines d'années. Leurs découvertes sont gardées secrètes du reste du monde, mais ils ne cherchent en aucun cas à utiliser leur technologie pour quelque usage que ce soit, seulement dans le but de continuer à progresser et à comprendre et communiquer avec Dieu par la raison plutôt que par les croyances religieuses.
Jusqu'au jour où, pendant la Seconde Guerre mondiale, une section SS des projets spéciaux, dirigée par le général Wilhelm « Totenkopf » Strasse (dit le Boucher), met la main sur une des caches des Da'at Yichud. À l'aide des secrets qu'elle renfermait, les SS ont développé des armes qui ont permis d'avoir une très grosse avance technologique par rapport aux Alliés. En 1946, les Nazis ont créé la bombe atomique, mettant fin à la guerre et à l'établissement d'un Nouvel Ordre mondial Nazi. En 1960, plus d'une décennie après la fin de la guerre, les Nazis continuent leurs recherches et leurs développements sur la technologie Da'at Yichud. Ils ont développé de nouvelles armes, tel le LaserKraftWerk, une toute nouvelle puissante arme passée sur l'énergie, ou bien encore des super-soldats ainsi que des robots. Ils ont même une base lunaire vers laquelle ils peuvent facilement voyager et où ils peuvent garder leurs secrets bien en sécurité.
Agent William Joseph « B.J. » Blazkowicz : Personnage principal du jeu. En 1946, il prend part à l'assaut de la forteresse du général Strasse. Blessé, il tombe dans le coma durant 14 ans.
Anya Oliwa : Infirmière polonaise qui travaillait dans un asile tenu par ses parents. Après l’assassinat de ces derniers par les nazis, elle sera sauvée par Blazkowicz.
Irene Engel (information trouvée sur le site officiel de Wolfenstein) : Second antagoniste du jeu. Elle est la commandante du camp de travail de Belica en Croatie.
Wilhelm Strasse : Également surnommé « Le Boucher ». C'est l'antagoniste principal durant tout le jeu. Chef de la section SS des projets spéciaux, c'est notamment lui qui a permis aux Nazis de gagner la Seconde Guerre mondiale grâce à ses inventions comme le super-soldat ou les Panzerhunds (sorte de chiens mécaniques géants). En 1960, il est Ministre des Projets Avancés.
Bubi : Antagoniste mineur du jeu. Il est le compagnon de Engel.
Fergus Reid (à noter que le joueur peut faire un choix s'il le sauve de Strasse au début du jeu, alors le soldat Wyatt sera tué à sa place) : Né en 1907 dans les Highlands d'Écosse, Fergus Reid a connu une vie relativement difficile ce qui lui a donné un sens plutôt cynique et sarcastique de la vie. Dans les années 1930, il trouve un travail dans la marine marchande mais la grande dépression a mis un terme à ses projets. Ce n'est qu'après avoir bu un certain nombre de verres qu'il s'engagea malgré lui dans la Royal Air Force.
Soldat Probst Wyatt III (peut être sauvé par le joueur, si ce dernier a choisi Fergus) : Né en 1928 aux États-Unis, Wyatt a d'abord étudié à l'université Harvard avant de s'engager dans les troupes aéroportées.
Friedrich Keller : Officier nazi qui ordonna l'exécution de tous les patients mentaux dans l’hôpital appartenant aux parents d'Anya Oliwa.
The Knife: Officier nazi travaillant dans le camp Belica. Il torture les prisonniers avec des couteaux pour le plaisir et pour obtenir aussi des informations.
Caroline Becker : Chef du Kreisau Circle. Elle a survécu lors de sa dernière confrontation avec le général Strasse.
J (disponible si on a choisi de sauver Wyatt) : Membre du cercle de Kreisau. Afro-américain, on sait de lui qu'il joue de la guitare. Ce personnage est très fortement inspiré de Jimi Hendrix, et d'ailleurs, à certains moments, il joue certaines de ses musiques.
Tekla (disponible si on a choisi de sauver Fergus) : Membre du Cercle de Kreisau. Tekla est une jeune femme obsédée par les calculs mathématiques et les équations. Voyant des possibilités et des connections partout, sa chambre est remplie de feuilles de calculs. Elle est inspirée du scientifique Nikola Tesla.
En 1946, Blazkowicz et un groupe de soldats alliés lancent un assaut désespéré contre le château du général Strasse pour arrêter la production d'armes avancées qui peut mener les forces alliées à la perte de la Seconde Guerre mondiale. Ayant presque réussi la mission, Blazkowicz échoue à détruire le complexe et tous les soldats alliés sont massacrés par les forces de défense allemandes. L'échec de la mission provoque la chute des Alliés et la victoire des nazis de la Seconde Guerre mondiale. Plus tard, en 1960, les nazis dominent la planète, le vétéran américain B. J. Blazkowicz se réveille, dans un asile, d'un coma découlant d'une blessure reçue lors d'une de ses missions passées. Il doit retourner la situation en s'attaquant aux forteresses et aux super-armes des nazis.
Le Couteau de combat (le joueur peut prendre plusieurs couteaux pour faire des coups plus rapides et en lancer sur les Nazis, et en garder un pour le corps à corps)
Le Pistolet de 1946, qui est calqué sur un Luger P08, un silencieux peut être monté sur cette arme
Le Pistolet mitrailleur, qui est calqué sur le Thompson (pistolet mitrailleur) et qui est seulement utilisable dans la première mission en 1946
Le Fusil d'assaut de 1946, qui est calqué sur le Stg 44, peut être manié en double si le joueur trouve un autre exemplaire de cette arme
Le pistolet de 1960, qui ressemble également à un Luger, mais avec un design plus « futuriste » et capable de tirer des rafales de 3 coups à l'instar d'un Beretta 93R
Le fusil d'assaut de 1960, dont l'apparence rappelle celle du fusil G3 et aussi celle du Stg 44, peut monter un lance-grenades intégré plus tard dans le jeu
Le fusil de précision, qui ressemble au fusil SCAR, peut, dans son tir secondaire, activer des canons à plasma
Le fusil à double canon (utilisé qu'à de rares moments dans le jeu, et apparaissant notamment pendant la mission à l'asile en 1960)
Le fusil automatique, basé esthétiquement sur le Benelli M4 Super 90, tire automatiquement des chevrotines et semble moins précis que le fusil à double canon
La grenade explosive à main de 1946, qui est calquée sur la Stielhandgranate, peut être lancée directement avec une touche (comme dans Halo ou les Call of Duty) ou en être équipée pour en lancer plusieurs (comme dans half-life et les premiers jeux Medal of Honor)
La grenade à main Tesla, qui peut provoquer des dysfonctionnements aux machines des Nazis et créer des diversions
