Patienten är en flicka, nu 11 år, född tre veckor för tidigt med kejsarsnitt på grund av tvärgående läge, födelsevikt 2720 g. Det fanns inga matningssvårigheter i spädbarnstiden eller senare. Motorisk och språklig utveckling var försenad: hon gick utan stöd vid 2½ års ålder och vid 3 års ålder sa hon sina första ord. Vid 10 års ålder kände hon till alfabetet och försökte sätta ihop bokstäver. Hon använde blöjor tills hon var 8–9 år. Hennes sömnmönster är milt oregelbundet med frekventa uppvaknanden. Medfödda missbildningar eller epilepsi har aldrig upptäckts. Hon har normal längd med längd längs 25:e till 50:e percentilen och vikt längs 25:e percentilen, men hennes huvudomkrets har varit i det nedre normala intervallet (2,5:e till 5:e percentilen). Hennes ansiktsdrag är också normala - hon är inte tydligt dysmorfisk. Beteendet är normalt utan autistiska drag, men bruxism är ett problem. Hon föredrar yngre barn. Hennes intellektuella nivå bedöms vara jämförbar med mild till måttlig utvecklingsstörning, formell IQ-testning har ännu inte gjorts. Vid 9 års ålder visade trio hela exome-sekvensering (WES), som jämförde barnets DNA-sekvenser med föräldrarnas, en de novo NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G-variant som bekräftades ytterligare av Sanger-sekvensering. I linje med andra NAA10 missense-varianter påverkar V111G-substitutionen en mycket konserverad aminosyra. NAA10 är ett protein med 235 aminosyror som anpassar den karakteristiska GNAT-veckningen som är gemensam för NAT:s katalytiska underenheter. Denna veckning består av sex eller sju β-strängar och fyra α-helixer. β-strängarna 2-5 utgör kärnan i proteinet. Dessa fyra β-strängar, tillsammans med α2-helixen och β6-β7-loop som är viktig för substratbindning, är mycket konserverade. V111 är belägen mot slutet av β5-strängen, och en valin i denna position är mycket konserverad i NAA10-homologer såväl som i flera andra NAT-katalytiska underenheter för vilka kristallstrukturer har lösts, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) och 4LX9 (ssNAT)) [–]. Sidokedjan av V111 bildar en hydrofob ficka tillsammans med Y145, M147, L119 och L109. Den är också i nära anslutning (3,7 Å) till svavelgruppen av acetyl-CoA (AcCoA), vilket kan indikera en roll för V111 i positionering av AcCoA. En glycin i denna position orsakar inte några steriska konflikter, men förlusten av den mer skrymmande hydrofoba sidokedjan av valin kan eventuellt orsaka strukturella förändringar som påverkar proteinets stabilitet eller AcCoA-bindning. För att funktionellt bedöma NAA10-V111G, uttryckte vi först His/MBP-NAA10-WT och His/MBP-NAA10-V111G i E. coli, renade enzymer och testade NAT-aktiviteten in vitro. I motsats till His/MBP-NAA10-WT var det svårt att få en bra proteinuttryckning av His/MBP-NAA10-V111G, och en stor del av de renade His/MBP-NAA10-V111G-molekylerna eluerades i tom volym i storleksexklusions-kromatografikolonnen. Detta indikerar att delar av proteinet aggregerades i enheter större än 200 kDa, mest sannolikt på grund av en förändring av proteinstrukturen eller minskad proteinstyrka. Enzymer som eluerades vid en kolonnvolym motsvarande monomer His/MBP-NAA10-V111G testades för katalytisk aktivitet och visade sig ha en ungefär 85% minskning av katalytisk aktivitet jämfört med His/MBP-NAA10-WT. På grund av den låga uttrycksnivån och proteinproduktionen av NAA10-V111G från E. coli transfektion och proteinrening, transfekterade vi HeLa-celler med plasmider som kodade för antingen V5-taggad NAA10-WT eller V5-taggad NAA10-V111G följt av immunoprecipitering (IP) av det överuttryckta proteinet med ett anti-V5-antikropp. Därefter mättes NAT-aktiviteten i utfällningen. NAA10 och NAA15 bildar en hög affinitetsproteinkomplex, och som förväntat ko-immunoprecipiterades endogent NAA15 med både överuttryckta NAA10-WT-V5 och NAA10-V111G-V5. Mängden NAA10 och NAA15 i varje prov bestämdes med SDS-PAGE och Western blotting. Band från Western blottet kvantifierades, och den uppmätta katalytiska aktiviteten korrelerades med mängden NAA10-V5 i provet (dvs. en blandning av monomerisk NAA10 och NAA10 i komplex med NAA15 – NatA-komplexet), och separat korrelerades med mängden NAA15 i provet (dvs. mängden NatA-komplexet). Resultatet från IP-aktivitetsexperimentet korrelerade väl med våra tidigare resultat: NAA10-V111G:s förmåga att acetylera den sura N-terminalen EEEI24 var kraftigt reducerad. Det visade sig dock även ha en andra intressant egenskap: Som kan ses från Western blottet i Fig., ko-immunoprecipiterades mer NAA15 med NAA10-V111G-V5 jämfört med NAA10-WT-V5. Detta återspeglades även i våra NAT-aktivitetsmätningar där den immunoprecipiterade NAA10-V111G-V5-provet visade högre NatA-produktionsbildning (för NatA-substratpolypeptid SESS24) jämfört med det immunoprecipiterade NAA10-WT-V5-provet när det korrelerades med mängden total NAA10-V5 i provet. När det korrelerades med mängden NAA15 i varje prov, var NatA-produktionsbildningen per NAA15-molekyl (och därmed NatA-komplexet) ungefär lika. Eftersom monomerisk NAA10 har en 1000 gånger lägre NAT-aktivitet mot NatA-substrat jämfört med NatA-komplexet [], var bidraget från monomerisk NAA10 på acetylering av SESS24 minimal. Sammantaget tyder detta på att NAA10-V111G har minskad katalytisk aktivitet i monomerisk form, men inte i komplex med NAA15. För att bedöma proteinomsättningen av NAA10-WT och NAA10-V111G uttryckte vi V5-taggad NAA10-WT och NAA10-V111G i HeLa-celler och utförde cykloheximid-chase-experiment. Som kan ses i figur 1, har NAA10-V111G-V5 en högre omsättningshastighet än NAA10-WT-V5. 2 timmar efter cykloheximid-behandling var den genomsnittliga mängden NAA10-V111G-V5 reducerad med ungefär 80 %, medan NAA10-WT-V5-molekyler reducerades med 20 % i förhållande till mängden NAA10-molekyler före cykloheximid-behandling. Även om mängden NAA10-V111G-V5 minskar drastiskt efter 2 timmar, verkar nivån av NAA10-V111G-V5 stabiliseras till omkring 20 %. Det överuttryckta NAA10-V111G-V5 är sannolikt närvarande både i en instabil monomerisk form som snabbt bryts ned och i komplex med NAA15, som stabiliserar enzymet och skyddar det från nedbrytning.