En 74-årig man kom till sin allmänläkare i augusti 2006 och klagade på minnesförlust och remitterades sedan till en neurolog. Han visade en snabb global kognitiv nedgång associerad med aggressivitet, bisarr beteende och språkförlust. Detta åtföljdes av svår anomi, desinhibering och ett MMSE-poäng på 10/30. Det fanns inga fokala tecken, myoklonus eller ataxi. Den kliniska försämringen var mycket snabb och i december 2006 hade han ett akinetiskt mutism-liknande syndrom med onormal kroppsställning. Två kranial magnetröntgen (MRI), i oktober och december 2006, inklusive T1, T2, FLAIR och DWI-sekvenser, visade måttliga tecken på hjärnatrofi men ingen ökning av onormal kortikal eller basala ganglionsignal. Elektroencefalogram (EEG) var inte diagnostiskt och protein 14-3-3-nivån i cerebrospinalvätskan (CSF) var normal. Patienten dog i mars 2007. Familjens historia av demens inkluderade en 80-årig bror som diagnostiserades med trolig Alzheimers sjukdom. Inga mutationer hittades i den öppna läsramen efter sekvensering av prionproteingenen (PRNP). En heterozygosismethioninvalin (MV) observerades i kodon 129. Moderata till måttliga svampformiga förändringar förekom i neocortex, putamen/globus pallidus och thalamus, med lesioner som var mer uppenbara i putamen och frontal cortex. Konfluenta vakuoler fanns inte i någon region. Med undantag för några få fokala vakuoler i det djupare molekylskiktet var cerebellär cortex i övrigt inte märkbar. Neuroner bevarades till största delen i cerebellär cortex och basala ganglier, även om fokala astroglioser sällan observerades. Mild till måttlig mikroglios förekom i cerebellär cortex och basala ganglier, och subkortikalt vitt material, respektive. Immunfärgning av PrP utan förbehandling med proteinase K visade stark färgning som kännetecknades av fina punktformiga avlagringar (synaptiska) och oregelbundna granulära, ofta sammanhängande, avlagringar som kunde kategoriseras som diffusa synaptiska. Perineuronala och cerebellär plack-liknande avlagringar, kuru-plack och florida plack var frånvarande. Efter PK-behandling försvann den stora majoriteten av färgningen, förutom några granulära PrP-resistenta avlagringar. Cerebellum visade ett diskret synaptiskt PrP-liknande mönster i molekyl- och granulärskikten som försvann efter PK-förbehandling. Känsligheten för PK-förbehandling visualiserades bäst i konsekventa sektioner med och utan förbehandling med PK. Parallella sektioner färgade med 3F4-antikroppen visade en markant reduktion av PrP-immunreaktivitet, utvärderad med densitometri, som involverade 70-80 % av den totala PrP-mängden i vävnadssnitt. Detta bekräftades ytterligare genom inkubering av vävnadssnitt med 1E4-antikroppen och jämförelse av PrP-immunhistokemiska mönster hos en sCJD MV1-fall med probanden. Som visas i figur, visade 3F4- och 1E4-synaptisk PrP-immunreaktivitet i det gemensamma MV1-fallet resistent PrP-immunreaktivitet. I motsats till detta var 3F4- och 1E4-immunreaktivitet praktiskt taget avskaffad efter PK-förbehandling hos probanden. Förutom dessa förändringar fanns neurofibrillära tangles och pre-tangles, liksom granuler (korn), i entorhinala och perirhinala cortices, subiculum och CA1 och CA3 regioner i hippocampus. Några pre-tangles och korn sågs också i amygdala. Dessa förändringar åtföljdes av några hyperfosforylerade tau-depositioner i neuroner i dentat gyre, lindade kroppar i den temporala lobs vita substans och peri-ventrikulära astrocyter. Spridda αB-kristallin-immunoreaktiva ballooned neurons var närvarande i entorhinala cortex och amygdala. Tau patologi var förenlig med Alzheimers sjukdomsstadium III och argyrophilic grain disease stadium 3. Amyloid plack och α-synuclein inklutioner var frånvarande. Inga abnormiteter hittades med anti-TDP-43 antikroppar. Standard PrP Western-blot-förfarande (10 % hjärnhomogenat och slutlig PK-koncentration på 440 μg/ml) misslyckades med att upptäcka PrPSc. Att öka volymen som laddades i gelet från 5 till 10 μl gav en extremt svag signal motsvarande 24 och 19 kDa under mättnadsfilm-exponeringstider. Minskade PK-koncentrationer (440, 100 och 50 μg/ml) visade en ökning i PrPSc-signalen, vilket antydde ett PK-känsligt prionprotein. Även då var endast två band av 24 och 19 kDa synliga. Efter att ha ökat hjärnhomogenatets procentandel till 20 % erhölls samma tvåbands-mönster. Med hjälp av TeSeE®-kit, som kännetecknas av mjukare PK-digestionsförhållanden följt av steg för rening och koncentration av proteinet och färgning med Sha31 Mab, avslöjades förekomsten av två oväntade band på 21 och 16 kDa. Detta bandprofil observerades i alla hjärnregioner och det var ett slående resultat, eftersom deras molekylvikt var annorlunda än den som tidigare upptäcktes med Mab 3F4 och 6H4. Genom att utföra en kombination av digestion, rening och koncentration av provet enligt TeSeE®-kit-rekommendationer, tillsammans med detektion med hjälp av 3F4 och 6H4, erhölls ett nytt mönster. Inte bara de tidigare banden på 24, 21, 19 och 16 kDa var närvarande i var och en av proverna, utan också ett mycket svagt band på 28 kDa och ett fragment av ungefär 6 kDa storlek observerades i vissa hjärnregioner. Vidare erhölls skillnader i signalintensitet med 3F4 och 6H4-antikroppar som antydde en differentiell affinitet för PrPSc, vilket kunde tolkas som en annorlunda proteinkonformation där 3F4-bindande epitop var mer exponerad än 6H4-bindande epitop. Analys av deglykosylering visade tre aglykosylerade isoformer av 19, 16 och 6 kDa, som var mer intensiva i cortex (parietal, frontal och temporal) och svagare i occipital cortex och putamen/globus pallidus. I thalamusregionen upptäcktes två band, ett mer intensivt band av 19 kDa och ett svagare band av 16 kDa. Slutligen var cerebellum den enda region där ett enda aglykosylerat band av 19 kDa observerades, liknande det som finns i sCJD typ 2. Vi kan dock inte utesluta möjligheten att detta fynd var resultatet av närvaron av en liten mängd PrPSc och en underrepresentation av de andra banden, som observerades i thalamus, där ett band av 16 kDa storlek endast observerades under längre exponeringstider. Bedömning av känslighet för PK-nedbrytning uppnåddes genom att mäta absorbansen av PrPSc före och efter behandling med proteinase K med användning av IDEXX HerdChek BSE-test. Denna teknik baseras på selektivt upptagande av PrPSc av en specifik kemisk polymer genom polyjoniska interaktioner i närvaro av PrPC från ett homogenatprov av hjärnan. Absorbansvärdena minskar med seriella utspädningar, så det kan antas att mängden PrPSc är direkt proportionell mot absorbansen. Målet med detta protokoll var att utföra relativ kvantifiering av PrPSc utan behandling med proteaser. Vi anser att införandet av ett nedbrytningssteg kan vara användbart för att enkelt utvärdera den relativa motståndskraften mot PK-nedbrytning. Resultaten visade att absorbansvärdena minskade efter PK-behandling i alla proverna (tabell). För multi-infarct encefalopati (MIE) och sCJD VV2, var signaldetektionen reducerad med 4,32 % respektive 2,02 %, men minskningarna var inte statistiskt signifikanta. I kontrast till detta visade prover från proband och sCJD MM1 en statistiskt signifikant (p < 0,005) reduktion av signalen med 79,82 % respektive 22,68 %. Absorbansvärden för MIE var under cut-off, på samma nivå som negativa kontroller. De återstående värdena var över cut-off. Dessa differentierade nivåer av signalreduktion är indikativa för tre nivåer av motstånd mot PK-nedbrytning: hög, mellan och låg. Ett högt motstånd mot PK-nedbrytning skulle representeras av en låg procentandel signalreduktion, som observerats för sCJD VV2. I detta fall skulle en reduktion av 2 % i signalen indikera att PK-nedbrytning endast skulle försämra en minimal fraktion av PrPSc, vilket skulle antyda ett högt motstånd hos det onormala prionproteinet. Ett mellanliggande motstånd skulle representeras av en något högre procentandel signalreduktion, som observerats i sCJD MM1, där 22 % skulle peka på en högre nedbrytbar fraktion av PrPSc än den som observerats i det föregående fallet. Detta skulle representera en proteintyp som endast är lite känslig för nedbrytning med proteaser, beroende på hjärnregion. Ytterligare undersökningar genomförs för att klargöra huruvida denna nedbrytningsnivå är associerad med MM1-proteintyp eller ett fenomen som är specifikt för detta ämne. Slutligen skulle ett lågt motstånd mot PK-nedbrytning representeras av en hög procentandel signalreduktion, till exempel de 79 % som observerats i probanden, vilket indikerar att en hög fraktion av PrPSc är nedbrytbar. Detta antyder förekomsten av onormala prionprotein typer som är extremt känsliga för proteasnedbrytning som potentiellt kan förbises av detektionsmetoder som bygger på den karakteristiska proteinresistensen hos det patologiska prionproteinet.