En 4-årig eurasisk utter född 2015 i ”Sendaviva, Natural Park of Navarra” (42°11′31″N, 1°09′54”O) (nordöstra Spanien) överfördes 2017 till djurparken ”Terra Natura” (södra Spanien). Djurparken ”Terra Natura” ligger i stadsområdet kring Murcia (38°00′40″N, 1°09′54”O). Utterhägnet bestod av ett område med fritt tillgängliga skydd och en damm med 4 djur av denna art (2 hanar och 2 honor). Inget anti-sandflygsinsektsmedel i form av en påförd vätska applicerades på utterna. I augusti 2019 visade djuret bilateral epistaxis, anorexi, apati och viktminskning som utfördes enligt beskrivningen av Cantos-Barreda et al. []. För att testa att TR-IFMA-analysen validerad för hundserum kan tillämpas på otters serum utfördes en Western blot-analys. Western blot utfördes i serum från otter med leishmanios-kompatibla tecken och från en hund som var leishmania-seropositiv med TR-IFMA. Serumen (1:2000-spädning) separerades under reducerande förhållanden på mini polyakrylamidgeler (0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS), 12 % lösande gel och 4 % staplinggel). De lösta proteinerna överfördes elektroforetiskt till en nitrocellulosalamin (Bio-Rad, USA) och placerades i ett ROTI®Lumin-substrat (Carl Roth, Tyskland) för att blockera i 2 timmar vid rumstemperatur. Får polyklonal antikropp anti-hund IgG2 (AHP498; Bio-Rad, USA) vid 1:1000-spädning användes som primär antikropp, medan kanin anti-får IgG-horseradiskperoxidase (HRP)-konjugerad (SAB3700702; Sigma-Aldrich, USA) vid 1:1000-spädning användes som sekundär antikropp för att detektera den bundna primära antikroppen. Signaldetektering utfördes med en Pierce ECL2-kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA) och digitaliserades i en Typhoon 9410-skanner (GE Healthcare, USA). Ett band på ungefär 150 kDa observerades i otterprovet såväl som i hundprovet (se figur och ytterligare fil). Dessa fynd bekräftade att TR-IFMA-analysen med får anti-hund IgG2 kunde detektera IgG2 av otter. TR-IFMA-analysen bestod av en icke-kompetitiv indirekt metod baserad på biotinylerad K39 rekombinant antigen som ett fångstreagens, och anti-hund IgG2 polyklonal antikropp (Sheep anti-Dog IgG2, Bio-Rad, USA) Eu3 +-märkt som en detektor. Testen inkluderade serum från en sjuk hund som var leishmania-seropositiv som en positiv kontroll, och serum från en frisk hund som var leishmania-seronegativ som en negativ kontroll. Analysen utfördes i en multi-etikett räknare (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). Resultaten uttrycktes som enheter av fluorometri för Leishmania (UFL). Gränsen sattes vid 22 UFL. En enzym-kopplad immunosorbent analys (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Spanien) som detekterade specifika IgG-antikroppar mot Leishmania spp. utfördes också enligt tillverkarens instruktioner. Serumenheter diluerades 1:20 och resultaten uttrycktes som S/P-förhållande, beräknat med optisk densitet (OD) för prov/OD för låg positiv kontroll. S/P-förhållandet över 1,1 ansågs som positivt. Förekomsten av DNA från Leishmania spp. i helblod och benmärg utvärderades genom amplifiering av kinetoplast-DNA-sekvensen från Leishmania spp. med användning av en rtPCR med primers och prober som tidigare beskrivits []. Benmärg togs genom fin-nålsaspiration från den costochondrala unionen och dränerades i ett 1 ml rör belagt med EDTA. DNA extraherades med användning av High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Tyskland), enligt tillverkarens instruktioner. rtPCR utfördes i QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Den interna kontrollen TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, USA) var inkluderad. rtPCR utfördes i en slutlig volym på 20 ul, inklusive 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, USA), 900 nM av varje primer, 200 nM av TaqMan-sonden, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA och 50 ng DNA från varje prov. Cyklingsparametrarna var: 50 °C i 30 s, 95 °C i 10 min, 45 cykler vid 94 °C i 30 s och 55 °C i 1 min. Varje provkörning inkluderade positiva och negativa kontroller och varje mätning utfördes i tre exemplar. För Leishmania-art-identifiering, renades PCR-produkterna från de positiva proverna med användning av High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Tyskland) och skickades för sekvensering till sektionen för molekylärbiologi vid universitetet i Murcia. De erhållna sekvenserna jämfördes med de som finns tillgängliga i GenBank. Som negativ kontroll utfördes samma analyser på en 3-årig eurasisk utter från samma djurpark utan kliniska tecken som överensstämmer med leishmanios. Alla resultat visas i tabell. Förekomsten av leishmanios bekräftades och specifik behandling administrerades (allopurinol 15 mg/kg/24 h/p.o.). Behandlingsövervakning utfördes i november 2019, efter 3 månaders behandling. Bilateral nefropati med hydronefros, mesenterisk lymfadenomegali och ascites observerades. CBC visade minskningar i vita blodkroppar och minskningar i trombocyter hos den leishmaniopositiva utter. Serumbiokemisk profil för den leishmaniopositiva utter visade hyperproteinemi, hyperglobulinemi, minskningar av PON-1 och ökningar av haptoglobin och ferritin. Urinanalysen visade proteinuri och minskningar i osmolaritet och specifik gravitet. Närvaron av anti-Leishmania IgG2-antikroppar och ett positivt resultat av rtPCR i form av helblod och benmärg observerades för den leishmaniopositiva utter. Sekvenseringen av positiva prover bekräftade identifieringen av L. infantum. Den amplifierade sekvensen visade 100 % likhet med en L. infantum referenssekvens. Dessutom observerades ovala mikroorganismer med en excentrisk kärna som var kompatibel med Leishmania spp. amastigoter i cytologin hos mjälten (Fig.