En 52-årig kvinna med historia av kolecystektomi och partiell resektion av den vänstra leverloben 2004 på grund av symtomatisk gallsten och flera intrahepatiska gallgångarnas kolelitiasis hade intermittent feber och progressiv gulsot från början av november 2014. Gallgångsobstruktion och misstänkt hepatisk hilar malignitet upptäcktes genom efterföljande ultraljudsundersökning, magnetisk resonans kolangiopankreatografi (MRCP), magnetisk resonansavbildning (MRI) och positronemissionstomografi-datortomografi (PET-CT). Exploratörlaparotomi utfördes i slutet av november 2014 (Ytterligare fil: Figur S1) och fann allvarlig intraabdominal adhesion, en klump (1 × 2 cm) med indurerad konsistens i den proximal vänstra levergången och disseminerade neoplastiska lesioner som infiltrerade den hilar av den gemensamma levergången, hepatoduodenum ligament, de omgivande lymfkörtlarna, levernäringsartären, portalvenen och celiakaxeln. Dessa fynd tvingade kirurgerna att ge upp radikal resektion. Purulent galla tömdes från den gemensamma kanalen och slempropp stack ut från väggen i gallgången. Partiella neoplastiska lesioner avlägsnades från de förstorade lymfkörtlarna, nubben i den vänstra levergången och marginalen av den gemensamma leverartären för patologisk undersökning. T-kanalens dränering installerades för att lindra gallvägsobstruktionen. Patologiska rapporter visade att naturen av tumören var dåligt differentierat adenokarcinom med differentieringsmarkörer av kolangiecyt; dessutom upptäcktes måttlig EGFR-uttryck i >90% av tumörcellerna. Denna patient diagnostiserades slutligen som avancerad icke-opererbar perihilar CCA. Fem veckor efter palliativ kirurgi fick patienten en 4-veckors kurs av TOMO-terapi på den hilar malignitet (DT = 60 Gy/25 F), en cykel av systematisk kemoterapi med albuminbundet paklitaxel enbart för hennes oacceptabla gastrointestinala toxiciteter och infusion av autologa cytokinframkallande celler. På grund av den progressiva ökningen av CA199, reexaminerades PET-CT omedelbart efter slutförandet av strålterapi och visade en ny metastatisk hypermetabolisk lesion i den hepatitiska caudate loben och förstorade mjukvävnad och retroperitoneal lymfnodmetastaser med onormal standardiserad upptagningsvärde (SUV) mellan levern och magen jämfört med PET-CT före strålterapi. Fyra veckor efter strålterapi, blev patienten inskriven i CART-EGFR-studien. Hennes prestationsstatus var 1 enligt kriterierna för Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Under förberedelsen av CART-EGFR-celler utvecklade hon hög feber, aggressiv gulsot och obstruktion av gallgången, åtföljd av den kontinuerliga förhöjningen av CA199 (från 100,5 till 413,5 U/ml), aggressiv ökning av total bilirubin, direkt bilirubin och andra gallgångsobstruktionsrelaterade enzymologiska index och behandlades med effektiva bredspektrumantibiotika och endoskopisk placering av gallgången i levern. Prövningarna (ClinicalTrials.gov identifier NCT01869166, NCT02541370) godkändes av Institutional Review Board vid det kinesiska PLA General Hospital. Ingen kommersiell sponsor var inblandad i studierna. De inskrivna patienterna gav skriftligt informerat samtycke enligt Helsingforsdeklarationen. DNA-sekvensen av enkelkedjiga variabelfragment (scFv) som riktar sig mot EGFR-antigen härleddes från JQ306330.1 (GenBank Number). Anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta CAR genererades och klonades in i pWPT-lentiviral-stammen, som beskrivs i detalj av Feng et al. []. Konstruktionen verifierades genom DNA-sekvensering. En pseudotyp, klinisk-grad, lentiviral vektor-supernatant producerades genom standard transient transfektion som McGinley et al. beskrev []. Enligt tillverkarens instruktioner för transfektion av Lipofectamine 3000 transfektion reagent (Invitrogen, USA), pWPT-anti-EGFR CAR plasmid, ps-PAX2 förpackningsplasmid, och pMD2.G kuvertplasmid transfekterades in i 293 T-celler. De lentivirala supernatanterna samlades och förvarades vid −80 °C. GFP-CD137-CD3zeta-vektorn konstruerades för att verifiera transduktions-effektiviteten med hjälp av FACSCalibur flödescytometri (BD Biosciences). DNA-sekvensen av scFv som riktar sig mot CD133-antigen härleddes från HW350341.1 (GenBank Number), generering, konstruktion och testning av CAR133 T-celler följde samma procedur som CART-EGFR-celler (Additional file: Figure S2). CART-celler tillverkades från autologa perifera mononukleära blodceller (PBMC) som samlades i cellprepareringsrör (BD Biosciences, San Jose, CA) renade från 80 till 100 ml helblod vid den kinesiska PLA:s allmänna sjukhus Good Manufacturing Practice Facility enligt de nuvarande standardiserade driftsprocedurerna. PBMC stimulerades med 50 ng/ml anti-CD3 MoAb (Takara, Japan) och 500 U/ml rekombinant humant interleukin-2 (Peprotech, USA) i GT-T551 medium (Takara). Lentiviral transduktion utfördes i GT-T551 medium med protaminsulfat (Sigma) i 24 timmar efter 2 dagars T-cellskultur. Därefter expanderades cellerna ytterligare i kulturpåsar (Takara) och skördades som CART-celler. Bakterier, svampar och endotoxin testades före infusion av CART-celler. CART-cellernas immunfenotyp analyserades med flödescytometri med fluorescerande märkta antikroppar som är specifika för färgning av CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L och CCR7. Isotypmatchade monoklonala antikroppar (BD Biosciences) användes för kontrollfärgning. CAR-uttryck beräknades baserat på GFP-CD137-CD3zeta-transducerade celler i samma sats för alla patienter med hjälp av flödescytometri. Datainsamling och analys utfördes med hjälp av en FACSCalibur-flödescytometri (BD Biosciences). Cytotoxicitet in vitro av CART-EGFR-celler testades genom samodling med EGFR-positiva tumörceller vid olika effektor-till-mål-förhållanden i 96-brunnar med hjälp av ett 4-timmars CCK-8 Detection kit (DOJINDO, Japan). Kvantitativ realtids-PCR (Q-PCR) användes för att bedöma nivån av CAR-fusionsgenen enligt ett tidigare beskrivet protokoll.13 Ett 153-bp (baspar) fragment som innehåller delar av CD8a-kedjan och den intilliggande 4-1BB-kedjan (den främre primären 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ och den bakre primären 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) amplifierades med hjälp av ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Beta-aktin användes som en intern kontroll. En 7-punkts standardkurva som bestod av 100 till 108 kopior/μl plasmid DNA som innehöll CAR-genen, förbereddes. Serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF och Granzyme B testades med en BD Biosciences mikrobead sandwich immunoassay enligt tillverkarens instruktioner. Enligt det odlingssystem som rapporterats tidigare [], genererades CART-EGFR-celler från de mononukleära cellerna i 80–100 ml av patientens perifera blod och släpptes för infusionerna. Av de infusionsceller som infunderades under den första cykeln av CART-EGFR-terapi var 99,14 % CD3+-celler huvudsakligen sammansatta av CD8+-undergruppen (62,26 %) och 23,61 % kännetecknades av den centrala minnesfenotypen (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Dessutom var 8,99 % av de infusionscellerna EGFR-positiva. Fenotypen och transfektions-effektiviteten hos infusionscellerna CART-EGFR i varje cykel dokumenteras i tabell. CART133-celler genererades och odlades enligt samma förfarande som CART-EGFR-celler. Av de infusionerade cellerna var 95,2 % CD3+-celler huvudsakligen sammansatta av CD8+-undergruppen (71,9 %) och 41,9 % var CD45RO+/CD62L+/CCR7+-undergruppen. Dessutom var 6,4 % av de infusionerade cellerna CD133-positiva. Detaljer finns dokumenterade i tabell. På grund av den nyligen genomförda strålbehandlingen inom 2 månader och intolerans mot kemoterapeutiska medel, administrerades patienten 4-dagars på varandra följande infusioner av 2,2 × 106/kg CART-EGFR-celler totalt utan någon konditioneringsterapi, och uppnåddes en PR vid hennes första bedömning 6 veckor senare, utvärderad enligt Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1 (RECIST 1.1) med både MRI och PET-CT, vilket illustrerade en minskning av metastatiska lesioner i levern i ca 80 % och en märkbar minskning av SUV, tillsammans med en snabb minskning av CA199 från 413,5 till 123,1 U/ml. CAR-transgenkopiernas antal i patientens perifera blod nådde en topp på 5916 pg/dl på dag 9 tillsammans med frisättning av cytokiner såsom interleukin-6 (IL-6) och C reaktivt protein (CRP). Den andra cykeln av CART-EGFR monoterapi administrerades med en dos av EGFR-CAR+ uttryckande T-celler 2,1 × 106/kg och utan någon pre-konditioneringsterapi eftersom CAR-transgenkopiernas antal i perifera blodet minskade nära baslinjenivån 2 månader efter den första infusionen av CAR-EGFR uttryckande genetiskt modifierade T-celler. Rutinundersökningar av MRI och PET-CT visade en ihållande PR tillsammans med en ytterligare minskning av CA199 till 61,2 U/ml. Intressant nog nådde toppen av CAR-transgenkopiernas antal efter den andra cykeln av infusion av CART-EGFR-celler inte en parallell eller högre nivå som den första cykeln av CART-EGFR-terapi gjorde. PR-statusen hos patienten bibehölls i 8,5 månader tills hon utvecklade frekvent ohanterligt kräkande, övre buksmärta och magsyra reflux, vilket inträffade i mitten av november 2015. Den efterföljande elektroniska gastroskopin visade en striktation av duodenalbulben och PET-CT bekräftade tumörprogression med illustration av flera nya SUV-abnormiteter i omentum majus, bukhinnan och bukhålan. Patienten behandlades därefter med 1 cykel av CART-EGFR-terapi kombinerad med 2 cykler av anti-programmatiskt celldödsprotein 1 (PD-1) monoklonalt antikropp (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), som administrerades i en dos av 100 mg varannan vecka. På samma sätt nådde antalet CAR-transgenkopior som övervakades i perifert blod inte en liknande toppnivå som vid infusionen av den första cykeln, även i kombination med anti-PD-1-antikropp. Trots att serum CA199 minskade tillfälligt från 326,3 till 210,8 U/ml, upptäckte följande PET-CT nyligen uppkomna metastaser i bäckenbotten, höger leverlob och vänster supraklavikulär lymfkörtel samt förstoring av tidigare tumörlesioner i buken jämfört med PET-CT före den kombinerade immunterapi. Eftersom mer än 90 % tumörceller uttryckte CD133-protein (Tilläggsfil: Figur S3), registrerades patienten sedan i CART133-studien och fick infusion av 1,22 × 106/kg CD133-specifika CART-celler utan konditioneringsbehandling. På grund av förekomsten av obstruktion i den nedåtgående duodenum och den resulterande ihållande svåra infektionen i gallvägarna samt leverabscess, som kan störa nivån av serum CA199 och behandlades med antibiotika, sköts den planerade bildutvärderingen upp till 2 månader efter infusionen av CART133-celler, där kontrastförstärkt CT visade en anmärkningsvärd krympning eller till och med försvinnande av vissa metastaser i bukhålan och bukhålan, vilket ledde till en utvärdering av PR och blodkulturer, som inte stödde diagnosen infektion, men under tiden ökade IL-6 och CRP och akut ökning av glutamisk-pyruvisk transaminase och glutamisk-oxalacetisk transaminase (>6ULN). Det fanns några spridda små utslag som uppträdde i vänster lår 2 veckor efter den första cykelinfusionen av CART-EGFR-cell, som gradvis förvärrades och blev uppenbart och kliande med presentationen av flera fjällande eller linjära utslag som spred sig från vänster lår till kalven och gick samman, vilket graderades 2 enligt den gemensamma terminologin för biverkningar 4.0 (CTCAE 4.0), när den andra cykeln av CART-immunterapi genomfördes. Utslagen biopsierades med illustration av lichen striatus-liknande patologiska förändringar såsom förlust av partiell epidermis, vakuolär degeneration av basala celler och infiltration av många T-lymfocyter i epidermis och dess bihang, och hanterades framgångsrikt med takrolimus salva. Ingen hypotension inträffade under hela CART-EGFR-behandlingen. Förutom mild illamående, kräkningar, frossa, feber och trötthet, förekom inga andra akuta biverkningar under kombinationsbehandlingen. Även om mjäll uppträdde och förvärrades efter den kombinerade immunterapi, var det inte nödvändigt med medicinska ingrepp. Serumnivåer av cytokiner såsom tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), IL-6 och CRP ökade något och framkallade inga symtom på cytokinfrisättning. Under infusionen av successiva dosökande CART133-celler under 4 dagar, förekom inga andra biverkningar förutom infusionsrelaterad mild feber och trötthet. Men på den andra morgonen efter att infusionen av CART133-celler avslutats, utvecklade denna patient intermittent övre buksmärta, frossa, feber (39,1 °C), sporadiska punktformiga blödningar och kongestiv utslag på hennes vader, som snabbt och diffust spred sig till hennes nacke, högra överarm, bröst, vänstra buk och retropharyngeala slemhinnor, åtföljd av klåda och diarré på eftermiddagen och försämrades ytterligare under de följande 10 dagarna och programvarusläkt protein ligand 1 (PD-L1) [,], vilket resulterar i en snabb förlust av deras cytolytiska och cytokinsekretionskapacitet och en övergång till ett tillstånd av hyporesponsivitet []. Dessutom uppvisar fasta tumörer ofta metaboliska avvikelser genom att de konsumerar viktiga aminosyror som är kritiska för T-cellernas aktivitet och inducerar hypoxi och en resulterande extracellulär matrisförsurning på grund av otillräcklig vaskulär tillförsel som är fientlig mot T-cellernas överlevnad []. Således är det nödvändigt att modulera tumörmikromiljön för att förbättra resultaten. I detta fall, trots att patienten inte fick någon direkt konditionering med syftet att omvandla tumörmikromiljön, behandlades hon med 60 Gy strålbehandling före immunterapi med ett ungefärligt 1 månadsintervall från slutet av strålbehandlingen till början av CART-cellinfusionen. Även om strålbehandlingen i sig inte lyckades utrota tumörcellerna, kan dess direkta och fördröjda effekt spela en roll i förstörelsen av tumörbärande stroma, förändra biologin i tumörmikromiljön, främja frisättningen av fler tumörassocierade antigener och förbättra immunigenkänningen []. Dessutom kan strålbehandling göra tumörer mer immunogena och mer mottagliga för en förbättrad attack av immunceller [] och till och med generera antitumöreffekter i de avlägsna metastaser som inte var lokalt bestrålade (kallad abskopal effekt) [, ]. Vi lägger därför fram en hypotes att strålbehandling kan vara en rimlig och effektiv konditioneringsterapi för att förbättra resultatet av CART-terapi. När resistensen mot CART-EGFR-terapi bekräftades försökte vi en gång en kombination av immunterapi med anti-PD-1-antikroppar i samband med infusion av CART-EGFR-celler på grundval av en preklinisk studie som visade att blockad av PD-1-immunsuppression avsevärt kunde förbättra den terapeutiska effekten av CART-cellterapi mot etablerade fasta tumörer []. Tyvärr slutade denna behandling med ett misslyckande där PET-CT visade på progression av sjukdomen, även om CA199 minskade tillfälligt. En möjlig förklaring är den oklara nivån av PD-L1-uttryck. Nyligen framhävdes PD-L1-uttryck för dess värde vid förutsägelse av terapeutiska effekter av anti-PD-1-läkemedel. Emellertid var tumörlesionen i detta fall svår att biopsiera på grund av dess anatomiska läge, vilket resulterade i att nivån av PD-L1-proteinuttryck på tumörceller inte kunde detekteras korrekt före inledningen av anti-PD-1-terapi, vilket innebär att det finns en möjlighet att PD-L1-uttryck i tumörmiljön kan vara på en låg nivå eller till och med negativt och därför leda till att anti-PD-1-behandlingen misslyckas. Samtidigt fanns det många andra parallella kontrollvägar som potentiellt kunde stödja resistens mot anti-PD-1-terapi [] Under denna situation var det viktigt att välja ett rationellt mål för nästa steg i patientens behandling. Nyligen har CSC i CCA rönt stor uppmärksamhet för deras starkt cancerframkallande egenskaper och nyckelroller i att förmedla självförnyelse, återväxt av tumör och terapeutisk resistens, vilket innebär att terapi som riktade sig mot ytmolekylmarkörer och signalvägar som är specifika för CSC skulle kunna vara en potent möjlighet för CCA [, ]. Bland molekylerna som används individuellt eller i kombination för att identifiera kolangiocarcinomstamceller är CD133 en av de viktigaste stamcellmarkörerna som är associerade med högre invasivitet och sämre prognos [] Shien och kollegor rapporterade också att CD133-positiva tumörceller visade större resistens mot postoperativ behandling än CD133 negativa celler, och ökad CD133-uttryck observerades i resterande cancerceller efter adjuvant behandling [] Baserat på ovanstående valde vi slutligen CD133 som målantigen för CART-immunterapi, vilket i sin tur gav ytterligare ett partiellt svar, och visade att CART-cocktail-immunterapi kan vara genomförbar och rationell. En annan viktig fråga av stor betydelse var toxiciteten, som kunde induceras av CART-EGFR-celler på de målantigener som uttrycktes på tumörceller och/eller samtidigt på normala vävnader, vilket kallas "on-target off-tumour effect". Skador på normala vävnader kan till och med uppstå genom oväntad korsreaktion med ett protein som inte uttrycks på tumörceller []. Sedan infusionen av CART-EGFR-celler påbörjades upplevde denna patient inte bara infusionsrelaterad feber, frossa och trötthet, utan även ihållande pyrexi, akut ökning av serumtransaminaser och fördröjd debut av hudutslag, åtföljt av en robust ökning av antalet CAR-transgener, IL-6 och CRP, även om nivåerna inte uppfyllde kriterierna för diagnos av cytokinfrisättningssyndrom [, ]. De massiva cytokiner som kunde produceras direkt av de infusionerade CART-cellerna återspeglade en stark immunrespons som kunde generera både antitumoreffekter på tumörceller och biverkningar på normala vävnader. Dessutom orsakade on-target off-tumour-effekten av CART-EGFR-celler antagligen orsaken till den framkallade hudtoxiciteten på grund av fördelningen av EGFR på epidermis []. Emellertid var alla dessa biverkningar milda, reversibla och hanterades med understödjande vård och topikal kortikosteroid. Tillägget av anti-PD-1-antikroppar förvärrade uppenbarligen inte toxiciteten hos CART-EGFR-immunterapi i detta fall. Icke desto mindre, i den efterföljande behandlingen av infusion av CART133-celler, drabbades denna patient av allvarliga dermatologiska, orala slemhinnesjukdomar och gastrointestinala toxiciteter såsom kongestiv utslag och hemorragier. Även om dessa toxiciteter hanterades framgångsrikt genom akuta medicinska ingrepp, inklusive intravenös methylprednisolon och anti-TNF-hämmare, kan den inneboende mekanismen till stor del bero på on-target off-tumour-effekten av CART133-celler som riktades mot CD133-antigenet som uttrycktes på normalt epitel och vaskulärt endotel. Samtidigt var det oklart om anti-PD-1-antikroppar och resterande CART-EGFR-celler in vivo kunde spela en roll i försämringen av toxiciteten hos CART133-immunterapi.