Detta var en 22-årig man med B-ALL som hade en tredje benmärgstransplantation (BM) före inskrivning i vårt kliniska protokoll med användning av TanCAR-T 19/22-celler. Han hade diagnostiserats med B-ALL med mer än 100 × 109/L WBC-tal och normal karyotyp i januari 2016. Efter fullständig remission (CR) 2 genomgick han en haplo-HSCT från sin far 10 månader efter den ursprungliga diagnosen. Han hade drabbats av hemorragisk cystit och akut GVHD i steg 1 inom 2 månader efter haplo-HSCT, vilket försvann med 15 dagliga doser av metylprednisolon 50 mg följt av 5 dagliga doser av metylprednisolon 100 mg. Tre månader efter utsättning av ciklosporin A och metylprednisolon, återkom hans sjukdom med 6,4% benmärgsblaster när han fortfarande hade fullständig donorschimärism, och gick snabbt framåt med 56,5% benmärgsblaster vid flowcytometri 10,6 månader efter haplo-HSCT, och odetekterbar donorschimärism noterades samtidigt. Han fick räddningschemoterapi med MOEP (3 dagliga doser av mitoxantron 10 mg, vindesine 4 mg, 3 dagliga doser av etoposid 100 mg, och 5 dagliga doser av dexamethason 15 mg) och hade svår benmärgsdepression och inget svar med 65,4% benmärgsblaster 1 månad efter den första cykeln av MOEP. Därefter behandlades han med vårt haplo-CAR-T 19 cellprotokoll. Han fick cytoreduktiv kemoterapi med vindesine och metylprednisolon plus hydroxyurea och lymfopressning med daunorubicin och cyklofosfamid, och hans benmärgsblaster sjönk till 12,7% före haplo-CAR-T 19 cellinfusion. Haplo-CAR-T 19 celler vid en dos av 4,91 × 106/kg (2,89 × 107 T-celler/kg, 17% transfektionseffektivitet) administrerades och inducerade MRD-negativ CR (MRD-CR) och full donorschimärism inom 2 veckor efter infusion. De infusionerade haplo-CAR-T 19 cellerna visade snabb expansion och nådde 15 281 kopior per mikrogram DNA inom de första 2 dagarna efter infusion, men sjönk från 3374 kopior per mikrogram DNA dag 7 till 468 kopior per mikrogram DNA dag 12; metylprednisolon 160 mg och dexamethason 5 mg användes dag 11 för behandling av cytokinfrisättningssyndrom (CRS) av grad 3. Han upplevde akut GVHD inom 1 månad efter haplo-CAR-T 19 cellinfusion, som var under kontroll med 5 dagliga doser av metylprednisolon 40 mg plus ciklosporin A 80 mg administrerat från dag 31 efter haplo-CAR-T 19 cellinfusion. Han upplevde dock en florid progression inom 1 månad efter att ha erhållit MRD-CR, med WBC-tal som ökade från 1,59 × 109 till 12,52 × 109/L och motsvarande procent av cirkulerande blaster som ökade från 1,39 till 67,37% inom 2 veckor; hans benmärg visade hög aktiv cellproliferation med 59,67% blaster som hade CD19+ CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD58+ CD33+ CD20− CD13− CD15−. Samtidigt var odetekterbar haplo-CAR-T 19 celler och donorschimärism dokumenterade. I detta fall kunde andra terapier, inklusive TanCAR-T 19/22-celler, snarare än räddningschemoterapi eller återinfusion av CAR-T 19-celler, vara ett potentiellt behandlingsalternativ för denna patient på grund av det dåliga svaret på räddningschemoterapi och dålig persistens av infusion av CAR-T 19-celler. Högre tumörbörda och kort tidsintervall efter avbrytande av steroider ökade dock risken för misslyckande av generationen av autologa CAR-T-celler; florid progression av sjukdomen gjorde att det var mindre genomförbart att vänta tills steroiderna hade avtagit. Donor-härledd TanCAR-T 19/22-cellterapi var ett optimalt tillvägagångssätt för att övervinna detta problem, men som det är känt, bör haplo-CAR-T-cellterapi inte rutinmässigt förespråkas vid tidigare GVHD som kräver steroider, huvudsakligen på grund av ökad oro för den höga risken för GVHD-reaktivering. Efter noggrannare övervägande av de kliniska fördelarna och riskerna med den andra haplo-CAR-T-cellinfusionen, registrerades han i vårt kliniska prövningsprogram med användning av haplo-TanCAR-T 19/22-celler. Hans far genomgick aferes och perifera mononukleära blodceller (PBMC) användes för att förbereda TanCAR-T 19/22-cellerna. Han fick cytoreduktiv kemoterapi med vindesin 4 mg och fem dagliga doser av metylprednisolon 80 mg och tre dagliga doser av hydroxiurea 3 g följt av en lymfdeletande kemoterapi med idarubicin vid en total dos av 30 mg och cyklofosfamid vid en total dos av 3 g. Planerad benmärgsprovtagning efter den ovannämnda kemoterapin och före haplo-TanCAR-T 19/22-cellinfusionen utfördes inte på grund av patientens dåliga följsamhet. Två dagar senare behandlades han med haplo-TanCAR-T 19/22-celler vid en total dos av 4,72 × 106 TanCAR-T 19/22-celler per kilogram (3,05 × 107 T-celler per kilogram, 15 % transfektionseffektivitet) administrerad via fraktionerad dosering (D0, 30 %; D1, 70 %) av säkerhetsskäl. De material och metoder som användes i produktionen av TanCAR-T 19/22 har beskrivits tidigare [–], med undantag för konstruktionen av CAR och källan till PBMC som användes för att tillverka TanCAR-T 19/22 celler. TanCAR-19/22 var en tandem CAR-molekyl, som bestod av en anti-CD22 scFv härledd från mus m971 mAb [] och anti-CD19 scFv härledd från mus FMC63 mAb [], förenade i tandem, human CD8α-hinge och transmembrandomän samt human CD137- och CD3ζ-signaleringsdomäner. En schematisk bild av TanCAR-19/22 visas i figur a. PBMC som användes för att tillverka TanCAR-T 19/22 celler samlades genom leukaferes snarare än färskt perifert blod (PB). Flödescytometri användes för att fastställa effektiviteten av TanCAR-19/22-transfektionen och kvantifiering av haplo-TanCAR-T 19/22-cellerna i kliniska prover med användning av en biotin-SP-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch, USA) och PE Streptavidin-antikropp (BD Biosciences, USA). Haplo-TanCAR-T 19/22-celler i kliniska prover mättes också med qPCR som beskrivs [] Omfattningen av givarnas transplantat i kliniska prover bedömdes med användning av kort tandem-repeteringsförstärkning och fluorescensmärkning multiplex-PCR kombinerat med kapillärelektrofores som beskrivs [] Serum interleukin (IL)-2, IL-6, IL-8, och IL-10 och tumörnekrosfaktor-α-nivåer analyserades i partier som beskrivits []. BM före haplo-TanCAR-T 19/22 cellprotokoll visade på övervägande blastceller med en frånvaro av normala BM-prekursorer. BM-flödescytometri dag 14 efter infusion av haplo-TanCAR-T 19/22-celler indikerade att det fanns 0,73 % resterande benmärgsblaster. Det bör noteras att dessa resterande leukemiska blaster uppvisade uttrycksmönstret CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD33+ CD19− CD20−, som inte upptäcktes av flödescytometri dag 28 i avsaknad av ytterligare behandling. Med tanke på den ofullständiga återhämtningen av trombocyt- och absolut neutrofilantal vid dag 28, uppnådde denna patient MRD-CRi vid dag 28 efter infusion. Det fanns inga bevis på blaster i benmärgen, varken genom benmärgsutstrykning eller genom flödescytometri vid seriemässiga tidpunkter därefter under 14 månader. BM hade återställt normal hematopoes vid dag 56 med undantag för trombocytantalet som fortfarande inte återhämtat sig till en nivå av 36 × 109/L vid tidpunkten för denna rapport. Fullständig donatorkimerism etablerades dag 14 efter infusion och förblev stabil därefter. Efter infusion expanderade och nådde haplo-TanCAR-T 19/22-celler en nivå av 30,7 % cirkulerande T-celler på dag 12 följt av en sammandragningsfas med en låg nivå av 0,45 % cirkulerande T-celler på dag 28. Detta sammanföll med elimineringen av cirkulerande B-celler som var nästan oupptäckta på dag 28 med flödescytometri. Haplo-TanCAR-T 19/22-celler var fortfarande mätbara med en låg nivå av 2,29 % cirkulerande T-celler och cirkulerande B-celler hade fortfarande inte återhämtat sig vid tidpunkten för denna rapport. Haplo-TanCAR-T 19/22-celler var också närvarande med flödescytometri vid alla tidpunkter för utvärderingen av responsen i BM som erhölls vid utvärderingen av responsen, och kronisk B-cell aplasi dokumenterades. En övergripande överensstämmelse mellan expansionen och persistensen av haplo-TanCAR-T 19/22-celler i PB mätt med flödescytometri och qPCR observerades. Vid tidpunkten för denna rapport var TanCAR-19/22 DNA fortfarande detekterbart med 1134 och 396 kopior per mikrogram DNA i PB och BM, respektive. Efter infusion av haplo-TanCAR-T 19/22-celler upplevde han grad 3 CRS graderad enligt UPenns graderingsskala [, ]. Feber på upp till 38,8 °C inträffade inom 24 timmar efter infusion av haplo-TanCAR-T 19/22-celler och varade i 11 dagar och blev afebril på dag 12 efter behandling med en lägre dos av tocilizumab på 160 mg (1,6 mg/kg) och etanercept 50 mg på dag 8. Flera serumcytokiner hade ökat markant 7 dagar efter infusion och blev nästan återställda till baslinjevärden på dag 41, där interleukin (IL)-6-nivåerna nådde en topp på 3377 pg/mL (88-faldigt över baslinjevärdet) på dag 11. Aspartataminotransferas och laktatdehydrogenas ökade signifikant 8 till 10 dagar efter infusion, nådde en topp på 1529,1 U/L (38-faldigt över övre normalgränsen) och 2027,8 U/L (13-faldigt över baslinjevärdet) på dag 12, och återgick till baslinjevärden på dag 21 med bästa stödjande vård. Han uppvisade också koagulationsdysfunktion med förlängd aktiverad partiell tromboplastintid, förhöjda D-dimer och fallna fibrinogennivåer, liksom kapillärläckage med grad 2 hypoalbuminemi trots intensiv tillskott av protein under CRS, vilket försvann på dag 23. Den tidigare akuta GVHD-skeden 3 som var under kontroll återaktiverades och utvecklades snabbt till GVHD-skeden 4 med nya lokala hudsår, särskilt i pungen och i munslemhinnan 11 dagar efter infusionen av haplo-TanCAR-T 19/22-celler. Koncentrationen av totalt serumbilirubin ökade kontinuerligt från dag 12 och ökade till 134 μmol/L på dag 21. Med tanke på de snabbt framskridande GVHD-manifestationerna och levernedsättningen, genomfördes en lägre dos av metylprednisolon 20 mg dagligen som initial dos med efterföljande minskning i ett försök att balansera fördelarna och riskerna med systemisk immunosuppression från dag 21 och avbröts på dag 39. Hudutslag och totalt serumbilirubin förbättrades signifikant efter dessa behandlingar. Emellertid inträffade GVHD-skeden 3 huvudsakligen med diarré från dag 50, och total serumbilirubin ökade igen, vilket antydde en grad 3 akut GVHD. Sexton doser av metylprednisolon 20 mg per dag administrerades igen från dag 78, vilket kontrollerade diarré och totalt serumbilirubin. Denna patient uppvisade därefter måttlig kronisk GVHD huvudsakligen manifesterad som skleroderma, diarré och viktminskning. Persistent trombocytopeni med trombocytantal från 15 × 109 till 43 × 109/L utan transfusion av trombocyt kunde erkännas som en manifestation av kronisk GVHD vid återställandet av normal hematopoes. Den systemiska immunosuppressiva behandlingen trappades ned inom 2 månader med metylprednisolon 4 mg varannan dag och metotrexat 5 mg en gång i veckan och sirolimus 1 mg dagligen som en minimimängd vid underhållsbehandling från dag 154 till tidpunkten för denna rapport, vilket höll den kroniska GVHD under god kontroll.