En 47-årig kvinna (vikt: 62 kg) diagnostiserades med kronisk aktiv HBeAg-positiv hepatit B 1996. Virala parametrar såsom HBeAg, anti-HBe IgG och HBV plasmavirustäthet från frysta prover mättes samtidigt av en unik operatör för att minska variationer inom och mellan analyser. HBeAg och anti-HBe bestämdes med elektrokemiluminiscens (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). HBV plasmavirustäthet bestämdes med realtids-PCR (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, dynamiskt område 30 IU/ml till 110 000 000 IU/ml) []. Leverinflammation mättes med serumalaninaminotransferas (ALT) nivåer. För sekvensanalys sekvenserades HBV pol- och preC-kärngener med primers som tidigare beskrivits []. Analysen utfördes med hjälp av ett ABI3100-instrument (Applied Biosystems), och sekvenserna som infördes i detta arbete samt de som erhölls från GenBank-databasen, justerades med ClustalX v1.83 [] och redigerades med Bioedit v7.0.9.0 [] HBV-genotypen bedömdes med hjälp av fylogenetisk inferens med Neighbor-joining-algoritmen med Kimura-två-parameters-modellen för molekylär evolution i MEGA v3.1-programvaran [] Sekvenser från båda generna erhölls vid olika tidpunkter under antiviral behandling. En mer detaljerad HBV pol-genklonanalys utfördes på sju utvalda virusisolat från serumprover som samlats in under sekvensbehandlingar. Varje vald PCR-produkt av pol-gen klonades in i pGEM-T Easy-vektorn enligt tillverkarens instruktioner (Promega, Wisconsin, USA) och minst 15 kloner analyserades ytterligare genom sekvensering. Detta gjorde det möjligt att analysera utvecklingen av virala kvasispecies under de successiva antivirala trycken baserat på analys av pol-genen. Interventionen med anti-HBV-behandling tillsammans med HBV-virusbelastningen och ALT-nivåns kinetik visas i figur. Terapi initierades när HBV-virusbelastningen steg till 6,5 × 106 IU/ml. 1998, när patienten behandlades med IFN-alfa 5 MU tre gånger i veckan under 30 veckor, var HBV-DNA-nivån lägre än detektionsgränsen. Denna terapi avbröts och ersattes 1999 med lamivudin (150 mg en gång dagligen). Efter 2 års kontinuerlig behandling var HBV-DNA detekterbar (15,5 × 106 IU/ml). HBeAg förblev negativ med detekterbara anti-HBe under denna behandlingsperiod. 2001, efter en 6-månaders avbruten behandling, visade HBV-DNA-nivån en efterbehandlingsflare (1 × 108 IU/ml). I slutet av 2003 återintroducerades lamivudin-terapi (150 mg en gång dagligen). Det åtföljdes av en sällsynt händelse av återgång till en HBeAg-positiv/anti-HBe negativ profil, som förblev detekterbar i två år. Virusbelastningen nådde 3,1 × 106 IU/ml vid denna tidpunkt. Tio månader senare, 2006, ersattes lamivudinregimen med adefovirmonoterapi (10 mg/dag). Initialt var virusnivåerna låga (8,5 × 104 IU/ml) men efter 48 veckors behandling nådde dessa nivåer 7,15 × 106 IU/ml. ALT-nivåerna var normala under detta intervall. Reaktivering av HBV-replikation antogs med tanke på den samtidiga upptäckten av HBeAg/anti-HBe [] och den höga replikation som upptäcktes. Samstämmighet mellan HBeAg och anti-HBe verkar inte vara ovanligt bland antivirala behandlingsnaiva patienter, men dess förekomst hos erfarna patienter är okänd. Detta serologiska mönster har varit kopplat till omfattande hepatocytskada och allvarlig immunmedierad leversjukdom och efterföljande dysfunktion []. Sex månader senare ökade ALT-nivån något (1,5 × övre normalgräns - UNL -) och entecavirmonoterapi inleddes (1 mg dagligen). Efter 5 månaders entecavir monoterapi, tillsattes tenofovir (300 mg en gång dagligen) till behandlingsschemat för dubbelterapi. HBV DNA minskade till 1 × 105 IU/ml under fyra månader, men tre månader senare nådde virusmängden > 1,1 × 108 IU/ml. Dessutom visade en ökning av ALT-nivån (20× UNL) på leverinflammation. Under de följande 48 veckorna minskade virusreplikationen något till 6,1 × 106 IU/ml men återhämtade sig först till 3,6 × 107 IU/ml och senare till > 1,1 × 108 IU/ml. På senare tid (andra halvåret 2010) fluktuerade HBV DNA-nivåerna mellan 4,3 × 104 IU/ml och 4,9 × 107 IU/ml. Vid slutet av studieuppföljningen kunde vi mäta tenofovirkoncentrationen i plasma med högpresterande vätskekromatografi i tre på varandra följande prover 20 timmar efter administrering och nådde 71,6 ng/ml ± 47,6 (medelvärde ± SD). ALT-AST-nivåerna förblev något förhöjda (2× UNL) under de två sista åren av uppföljningen. HBV-isolat från patienten tillskrevs genotyp A2 baserat på fylogenetisk släktskap mellan partiella HBV-genomiska sekvenser från både pol- och preC-C-gener. En ytterligare longitudinell genotypisk analys, inklusive kvasispecifika sammansättningar av HBV-stammar isolerade från patienten, avslöjade förekomsten av resistensmutationer baserat på pol-gensekvenser (tabell). I början av lamivudinbehandlingen var HBV vildtyp i alla kloner. Efter 2 år under sådan behandling ersattes denna viruspopulation helt av mutationen rtM204I - som homogent uppvisade lamivudinresistens. När denna behandling avbröts i 6 månader, bestod kvasispecifika sammansättningar nästan uteslutande av vildtyp-pol-nukleotidsekvenser, förutom ett mindre bidrag (< 10%) som visade adefovir-resistensassocierade mutation I233V. När lamivudinbehandlingen återinfördes, och fram till dess att entecavir plus tenofovir administrerades, upptäcktes de dubbla lamivudinresistensassocierade mutationerna rtL180M och rtM204I. Under det senare terapeutiska schemat upptäcktes endast ephemeralt och med mindre bidrag (< 10%) A181T- och T184L-lamivudin-adefovir- och entecavir-resistensassocierade mutationer. Dessutom upptäcktes ytterligare två varianter i den katalytiska domänen i omvänd transkriptas vid tidpunkten för lamivudinresistens. Dessa rtA200V- och rtI253V-varianter var fortfarande närvarande under entecavirterapi och upptäcktes även i prover som sekvenserades efter genombrott under entecavirterapi. HBV-genomisk karakterisering på preC-C-nivå visade förekomsten av A1762T och G1764A dubbelmutation som tidigt upptäcktes när patienten var obehandlad och förblev i detta tillstånd under hela uppföljningen. T1753C-mutationen upptäcktes också konsekvent. Förekomsten av dessa kärnpromotormutationer är också relaterade till den ovannämnda HBeAg-antiHBe samtidiga profilen som finns hos denna patient, som nyligen rapporterats [].