Пациентка - девочка, сейчас ей 11 лет, родилась на три недели раньше срока, путем кесарева сечения, вес при рождении 2720 г. В младенчестве и позже не было проблем с кормлением. Моторное и речевое развитие было отставанием: она ходила без поддержки в возрасте 2,5 лет, а в возрасте 3 лет сказала свои первые слова. В возрасте 10 лет она знала алфавит и пыталась складывать буквы вместе. Она использовала подгузники до 8-9 лет. Ее сон был слегка нерегулярным с частыми пробуждениями. Врожденные пороки развития или эпилепсия никогда не были обнаружены. У нее нормальный рост с длиной по 25-50-му перцентилю и весом по 25-му перцентилю, но окружность ее головы была в нижней нормальной области (2,5-5-й перцентиль). Ее черты лица также нормальные - она не явно дисморфическая. Поведение нормальное без аутичных черт, но бруксизм является проблемой. Она предпочитает компанию младших детей. Ее интеллектуальный уровень оценивается как сравнимый со слабой-умеренной ИР, формальное тестирование IQ еще не было сделано. В возрасте 9 лет трио полного секвенирования экзома (WES), сравнивающее ребенка с родительскими ДНК-последовательностями, выявило вариант NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G, который был дополнительно подтвержден секвенированием по методу Сангер. В соответствии с другими вариантами NAA10 missense, замена V111G влияет на высококонсервативную аминокислоту (рисунок, панели A и B). NAA10 представляет собой белок из 235 аминокислот, который адаптирует характерный склад GNAT, общий для каталитических субъединиц NAT. Этот склад состоит из шести или семи β-цепей и четырех α-спиралей (рисунок,). β-цепи 2-5 составляют ядро белка. Эти четыре β-цепи вместе с α2-спиралью и β6-β7-петлей, важной для связывания субстрата, являются высококонсервативными. V111 находится ближе к концу β5-цепи, и валин в этом положении высококонсервативен в гомологах NAA10, а также в нескольких других каталитических субъединицах NAT, для которых были решены кристаллические структуры (рисунок, данные не показаны (PDB ID: 5K04 (NAA20), 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) и 4LX9 (ssNAT)) [–]. Боковая цепь V111 формирует гидрофобный карман вместе с Y145, M147, L119 и L109. Он также находится в непосредственной близости (3.7 Å) к серых группе ацетил-КоА (AcCoA), что может указывать на роль V111 в позиционировании AcCoA (рисунок,). Глицин в этом положении не вызывает каких-либо стерических столкновений, но потеря более громоздкой гидрофобной боковой цепи валина может, возможно, вызвать структурные изменения, влияющие на стабильность белка или связывание AcCoA. Чтобы функционально оценить NAA10-V111G, мы сначала экспрессировали His/MBP-NAA10-WT и His/MBP-NAA10-V111G в E. coli, очистили ферменты и проверили активность NAT in vitro. В отличие от His/MBP-NAA10-WT, было трудно получить хорошую экспрессию белка His/MBP-NAA10-V111G, и значительная часть очищенных молекул His/MBP-NAA10-V111G eluировалась в пустом объеме колонки хроматографии исключения размера (фиг., панели A и B). Это указывает на то, что части белкового агрегата в единицах больше 200 кДа, скорее всего, из-за изменения белковой структуры или уменьшенной белковой стабильности. Ферменты, которые eluировались в объеме колонки, соответствующем мономерной His/MBP-NAA10-V111G, были проверены на каталитическую активность и показали примерно 85% снижение каталитической активности по сравнению с His/MBP-NAA10-WT (фиг., панели C и D). Из-за низкого уровня экспрессии и низкого выхода белка NAA10-V111G из E. coli после трансфекции и очистки белка мы трансфектировали клетки HeLa плазмидами, кодирующими V5-меченый NAA10-WT или V5-меченый NAA10-V111G, а затем подвергли иммунопреципитации (IP) сверхэкспрессированного белка антителом против V5. После этого измеряли активность NAT в precipitate (фиг. ). NAA10 и NAA15 образуют белковый комплекс с высокой аффинностью (фиг. ), и, как ожидалось, эндогенный NAA15 ко-иммунопреципитованный с обоими сверхэкспрессированными белками NAA10-WT-V5 и NAA10-V111G-V5. Количество NAA10 и NAA15 в каждом образце определялось с помощью SDS-PAGE и Western blot. Полосы с Western blot были количественно определены, а измеренная каталитическая активность была соотнесена с количеством NAA10-V5, присутствующим в образце (то есть смесь мономерного NAA10 и NAA10 в комплексе с NAA15 – NatA-комплекс), и отдельно соотнесена с количеством NAA15, присутствующим в образце (то есть количество NatA-комплекса). Результаты эксперимента по IP-активности хорошо согласуются с нашими предыдущими результатами (фиг. ): способность NAA10-V111G ацетилировать кислую N-терминал EEEI24 была значительно снижена (фиг., панели B и C). Однако это также выявило вторую интересную особенность: как видно из Western blot на фиг., больше NAA15 ко-иммунопреципитованного с NAA10-V111G-V5 по сравнению с NAA10-WT-V5. Это также отражено в наших измерениях активности NAT, где иммунопреципитованный NAA10-V111G-V5 образец показал более высокую продукцию NatA (для субстратного полипептида NatA SESS24) по сравнению с иммунопреципитованным NAA10-WT-V5, когда коррелировали с количеством общего NAA10-V5, присутствующего в образце (фиг. ). Однако, когда коррелировали с количеством NAA15, присутствующего в каждом образце, образование продукта NatA было примерно равное (фиг. ). Поскольку мономерный NAA10 имеет в 1000 раз меньшую активность NAT по отношению к субстрату NatA по сравнению с NatA-комплексом [], вклад мономерного NAA10 в ацетилирование SESS24 минимален. В совокупности это позволяет предположить, что NAA10-V111G имеет пониженную каталитическую активность в мономерной форме, но не в комплексе с NAA15. Чтобы оценить белковый оборот NAA10-WT и NAA10-V111G, мы экспрессировали V5-меченые NAA10-WT и NAA10-V111G в клетках HeLa и провели эксперименты с циклогексимидом. Как видно из фиг., NAA10-V111G-V5 имеет более высокий оборот, чем NAA10-WT-V5. Через 2 часа после обработки циклогексимидом среднее количество NAA10-V111G-V5 уменьшилось примерно на 80%, тогда как количество молекул NAA10-WT-V5 уменьшилось на 20% относительно количества молекул NAA10 до обработки циклогексимидом. Хотя количество NAA10-V111G-V5 резко уменьшилось через 2 часа, уровень NAA10-V111G-V5, похоже, стабилизируется на уровне около 20%. Вероятнее всего, сверхэкспрессированная NAA10-V111G-V5 присутствует как в нестабильной мономерной форме, которая быстро разрушается, так и в комплексе с NAA15, который стабилизирует фермент и защищает его от разрушения.