74-летний мужчина обратился к своему лечащему врачу в августе 2006 года с жалобами на потерю памяти и был затем направлен к неврологу. У него наблюдалось быстрое глобальное когнитивное снижение, связанное с агрессивностью, странным поведением и потерей речи. Это сопровождалось выраженной аномией, расторможенностью и оценкой 10/30 по MMSE. Не было никаких очаговых признаков, миоклонии или атаксии. Клиническое ухудшение было очень быстрым, и к декабрю 2006 года он находился в синдроме акинетики-мутизма с ненормальным положением тела. Два исследования с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) в октябре и декабре 2006 года, включая последовательности T1, T2, FLAIR и DWI, показали умеренные признаки атрофии мозга, но не увеличение аномального кортикального или базального ганглийного сигнала. Электроэнцефалограмма (ЭЭГ) была не диагностической, а уровень белка 14-3-3 в спинномозговой жидкости (СМЖ) был нормальным. Пациент умер в марте 2007 года. Семейная история деменции включала 80-летнего брата с диагнозом вероятное заболевание Альцгеймера. После секвенирования гена прионного белка (PRNP) в открытом читаемом формате не было обнаружено никаких мутаций. В кодоне 129 была обнаружена гетерозиготность метионина валина (MV). Умеренно-мягкие спонгиформные изменения были обнаружены в неокортексе, путамене/глобусе паллидусе и таламусе, причем очаги были более выражены в путамене и лобной коре (рисунок и). Конфлюентные вакуоли не были обнаружены ни в одном регионе. За исключением нескольких очагов вакуолей в более глубоком молекулярном слое, мозжечковая кора была в остальном незаметна (рисунок). Нейроны были в основном сохранены в мозжечковой коре и базальных ганглиях, хотя очаги астроглиоза редко наблюдались (рисунок). Мягко-умеренные микроглиозы были обнаружены в мозжечковой коре и базальных ганглиях, а также в подкорковом белом веществе (рисунок и). Иммуноокрашивание PrP без предварительной обработки протеазой показало сильную окраску, характеризующуюся тонкими точечными отложениями (синаптическими), а также нерегулярными гранулированными, часто сливающимися, отложениями, которые можно было классифицировать как диффузный синаптический (рисунок и). Периневральные и мозжечковые бляшки, бляшки Куру и яркие бляшки отсутствовали. После предварительной обработки протеазой подавляющее большинство окрашивания исчезло, за исключением нескольких гранулированных отложений PrP, устойчивых к протеазе (рисунок и). Мозжечок показал дискретную синаптическую картину в молекулярном и гранулированном слоях, которая исчезла после предварительной обработки протеазой (рисунок). Чувствительность к предварительной обработке протеазой лучше всего визуализировалась в последовательных срезах с предварительной обработкой и без предварительной обработки протеазой (рисунок). Параллельные срезы, окрашенные антителом 3F4, показали заметное снижение иммунореактивности PrP, что было оценено с помощью денситометрии, и это включало 70-80% общего количества PrP в срезах ткани. Это было подтверждено инкубацией срезов ткани антителом 1E4 и сравнением иммуногистохимической картины одного случая sCJD MV1 с пробандным. Как показано на рисунке, синаптическая иммунореактивность PrP в общем случае MV1-случае показала резистентную иммунореактивность PrP (рисунок). Напротив, иммунореактивность 3F4 и 1E4 была практически полностью подавлена после предварительной обработки протеазой в пробандном случае (рисунок). В дополнение к этим изменениям, нейрофибриллярные клубки и предклубки, а также гранулы (зерна), были обнаружены в энторинальной и периринтальной кортиксах, субцикуле и областях CA1 и CA3 гиппокампа. Несколько предклубков и зерен также были обнаружены в миндалине. Эти изменения сопровождались несколькими гиперфосфорилированными отложениями тау в нейронах зубчатой извилины, спиралевидных телах белого вещества височной доли и перивентрикулярных астроцитах. В энторинальной коре и миндалине присутствовали рассеянные иммунореактивные нейроны с баллонами, содержащими альфа-бета-кристаллин. Патология тау соответствовала стадии III болезни Альцгеймера и стадии 3 болезни аргарофильных зерен. Амелоидные бляшки и включения альфа-синуклеина отсутствовали. Не было обнаружено никаких отклонений при исследовании антител против TDP-43. Процедура стандартного Western-блоттинга PrP (10% гомогената мозга и конечная концентрация PK 440 мкг/мл) не выявила PrPSc. Увеличение объема, загруженного в гель, с 5 до 10 мкл, привело к появлению крайне слабого сигнала, соответствующего 24 и 19 кДа, при времени экспозиции пленки, соответствующем насыщению (рисунок). Уменьшение концентрации PK (440, 100 и 50 мкг/мл) показало увеличение сигнала PrPSc, что наводит на мысль о PK-чувствительном прионном белке (рисунок). Но даже тогда были видны только две полосы 24 и 19 кДа. После увеличения процента гомогената мозга до 20% был получен тот же двухполосный паттерн. С помощью набора TeSeE®, который характеризуется более мягкими условиями расщепления белка ПК с последующими этапами очистки и концентрации белка и окрашивания с помощью антитела Sha31, было выявлено наличие двух неожиданных полос с молекулярным весом 21 и 16 кДа (рисунок). Этот профиль полос наблюдался во всех областях мозга и представлял собой поразительный результат, поскольку их молекулярный вес отличался от того, который был ранее обнаружен с помощью антител 3F4 и 6H4. Выполнение комбинации расщепления, очистки и концентрации пробы в соответствии с рекомендациями набора TeSeE® вместе с детектированием с помощью антител 3F4 и 6H4 дало новый образец. Не только предыдущие полосы с молекулярным весом 24, 21, 19 и 16 кДа присутствовали в каждой из проб, но также очень слабая полоса с молекулярным весом 28 кДа и фрагмент размером примерно 6 кДа наблюдались в некоторых областях мозга (рисунок). Кроме того, были получены различия интенсивности сигнала с помощью антител 3F4 и 6H4, что позволяет сделать вывод о различном аффинности к PrPSc, которая может быть интерпретирована как различная конформация белка, в которой эпитоп, связывающийся с антителом 3F4, был более экспонирован, чем эпитоп, связывающийся с антителом 6H4. Анализ дегликозилирования выявил три агликозилированных изоформы 19, 16 и 6 кДа, которые были более интенсивными в коре (теменной, лобной и височной) и слабее в затылочной коре и путамене/глобусе. В области таламуса были обнаружены две полосы, более интенсивная 19 кДа и слабее 16 кДа. Наконец, мозжечок был единственной областью, где наблюдалась одна агликозилированная полоса 19 кДа (рисунок), аналогичная той, которая была обнаружена в sCJD типа 2. Однако мы не можем исключить возможность того, что это открытие было результатом присутствия небольшого количества PrPSc и недостаточной представленности других полос, как это наблюдалось в таламусе, где полоса размером 16 кДа наблюдалась только при более длительном времени экспозиции пленки. Оценка чувствительности к расщеплению протеинкиназы была достигнута путем измерения поглощения PrPSc до и после обработки протеиназой K с использованием теста IDEXX HerdChek BSE. Эта технология основана на селективном захвате PrPSc специфическим химическим полимером посредством полиионных взаимодействий в присутствии PrPC из пробы гомогенатов мозга. Значения поглощения уменьшаются при серийном разведении, поэтому можно предположить, что количество PrPSc прямо пропорционально поглощению. Цель этого протокола состояла в том, чтобы выполнить относительную количественную оценку PrPSc без обработки протеиназой. Мы считаем, что введение стадии расщепления может быть полезным для простой оценки относительной устойчивости к расщеплению протеинкиназы. Результаты показали, что значения поглощения уменьшились после обработки протеиназой K во всех пробах (таблица). Для мультиинфарктной энцефалопатии (МИЭ) и sCJD VV2, детекция сигнала была уменьшена на 4,32% и 2,02%, соответственно, но уменьшение не было статистически значимым. Напротив, пробы от пробонанда и sCJD MM1 показали статистически значимое (p < 0,005) уменьшение сигнала на 79,82% и 22,68%, соответственно. Значения поглощения для МИЭ были ниже порога, на том же уровне, что и отрицательные пробы. Остальные значения были выше порога. Эти дифференцированные уровни снижения сигнала свидетельствуют о трех уровнях устойчивости к расщеплению PK: высоком, промежуточном и низком. Высокая устойчивость к расщеплению PK будет представлена низким процентом снижения сигнала, как это наблюдается для sCJD VV2. В этом случае снижение сигнала на 2% будет указывать на то, что расщепление PK приводит к деградации только минимальной доли PrPSc, что позволяет предположить высокую устойчивость аномального прионного белка. Промежуточная устойчивость будет представлена немного более высоким процентом снижения сигнала, как это наблюдается для sCJD MM1, в котором 22% будет указывать на более высокую деградируемую долю PrPSc, чем та, что наблюдается в предыдущем случае. Это будет представлять собой тип белка, который лишь немного чувствителен к деградации протеазами, в зависимости от области мозга. Дальнейшие исследования проводятся для того, чтобы выяснить, связано ли это уровень деградации с типом белка MM1 или с явлением, специфичным для этого субъекта. Наконец, низкая устойчивость к расщеплению PK будет представлена высоким процентом снижения сигнала, например, 79% наблюдаемых у пробонда, что указывает на то, что деградируется высокая доля PrPSc. Это позволяет предположить существование аномальных типов прионного белка, которые крайне восприимчивы к расщеплению протеазами и которые потенциально могут быть упущены из виду методами обнаружения, основанными на характерной протеазной устойчивости патологического прионного белка.