11-летний неповрежденный немецкий овчарка (GSD) был направлен в отделение неотложной помощи факультета ветеринарной медицины Утрехтского университета с двухдневной историей острой одышки и общей слабости. Регулярно проводились вакцинация и дегельминтизация. Собака посетила Южную Европу за 6 месяцев до появления клинических симптомов. До появления клинических симптомов не применялись никакие препараты, и не сообщалось о каких-либо обстоятельствах окружающей среды, которые могли бы вызвать одышку (например, табачный дым, воздействие органических растворителей, пыль). Физический осмотр показал реагирующего, но вялого пса с генерализованной слабостью, выраженной диспноэ, цианотическими слизистыми оболочками, длительным временем капиллярного наполнения, слабыми периферическими пульсами, тахикардией (частота сердечных сокращений 180 ударов/мин) и систолическим шумом первой степени с максимальной интенсивностью над правым верхушкой сердца. При аускультации легких были слышны резкие звуки. Полный анализ крови (ПАК) показал умеренный зрелый лейкоцитоз (белые клетки крови: 18,9 × 109/л; диапазон значений 4,5–14,6 × 109/л) и гематокрит 56% (диапазон значений 42–61%). Биохимия не показала никаких отклонений. Анализ газов артериальной крови показал сильную гипоксемию (PaO2: 48,5 мм рт.ст.; диапазон значений 85–103 мм рт.ст.) и умеренную гипокапнию (PaCO2: 27,0 мм рт.ст.; диапазон значений 32–43 мм рт.ст.). Предполагаемой причиной гипокапнии была гипервентиляция. Концентрации димер-Д и антитромбина находились в пределах диапазонов значений. Тест на антитела к Dirofilaria immitis (тест SNAP® Heartworm RT, IDEXX Laboratories) и исследование кала (метод флотации и изоляции личинок Баерманна) были отрицательными. Радиография грудной клетки показала расширение ствола легочной артерии и правостороннюю кардиомегалия (рис. ) Эхокардиография была сильно затруднена из-за сильного беспокойства и одышки собаки и поэтому была ограничена. Она показала сильное расширение правого желудочка, умеренное равномерное расширение главной легочной артерии, систолическое уплощение межжелудочковой перегородки и умеренное трикуспидальное регургитацию (рис. a). Применение модифицированного уравнения Бернулли к скорости трикуспидального регургитационного потока показало расчетный систолический артериальное давление в легочной артерии 77 мм рт. ст., которое было классифицировано как тяжелая легочная гипертензия (относительный показатель < 25 мм, тяжелая > 75 мм рт. ст.) ([]. Левая часть желудочка была значительно уменьшена, что соответствовало уменьшению левостороннего объема. Была проведена эхокардиография с контрастным веществом, которая была отрицательной, что исключало внутри- и внекардиальную правую-левую перетоку. Для лечения тяжелой гипоксемии и легочной гипертензии собаку поместили в кислородную камеру с концентрацией кислорода в inspired air между 40 и 50%. Кроме того, собаке давали 1,5 мг/кг/8 ч орального силденафила (Виагра®, Pfizer, Нью-Йорк, США) и 0,25 мг/кг/12 ч орального пимобендана (Ветамид®, Boehringer Ingelheim, Германия). Эта терапия не оказала значительного влияния на клиническое состояние собаки. Однако артериальная гипоксемия немного улучшилась после первого дня терапии (PaO2 увеличилась с 48,5 до 53 мм рт. ст., относительный показатель 85–103 мм рт. ст.). Эхокардиография была повторена на третий день терапии, и изменения в эхокардиографии и тяжесть легочной гипертензии значительно уменьшились. Расширение правого желудочка резко уменьшилось, межжелудочковая перегородка больше не была уплощена, а градиент давления трикуспидального регургитационного потока уменьшился с 77 мм рт. ст. до 41 мм рт. ст. (относительный показатель < 25 мм рт. ст.) (рис. b). Поэтому терапия с пимобенданом и силденафилом была продолжена в течение госпитализации (7 дней). В качестве дальнейших диагностических шагов через 4 дня после первоначального обследования был проведен (пред- и послеконтрастный) компьютерный томографический (КТ) сканирование с апноэ, после чего была проведена хирургическая биопсия легких в том же сеансе анестезии. Был использован однослойный спиральный томограф (Philips Secura, Philips NV, Эйндховен, Нидерланды). Технические настройки включали 3 мм спиральные срезы, 120 кВ, 200 мА, 292 мм поле зрения, 512 × 512 матрицу и алгоритм высокой пространственной частоты. На КТ-изображениях паренхима легких показала тонкие центролобулярные стеклянные узелки и увеличенную легочную артерию. Септальные линии, плевральный выпот и лимфаденопатия отсутствовали (рис. а, б). КТ-положительные данные были совместимы с PH без убедительного диагноза. После КТ-сканирования была проведена биопсия левого краниального легочного лоба (3 × 2 см) для гистопатологического исследования с мини-торакотомией. Сразу после этой процедуры была начата терапия дексаметазоном (0,25 мг/кг q24 h I.V., Rapidexon ®, Eurovet Animal Health, Bladel, Нидерланды) в качестве крайней меры, пока не были получены гистопатологические результаты (3 дня). Исследование биопсии хирургической части легкого показало умеренный хронический интерстициальный гистиоцитарный пневмонит неизвестной этиологии и ателектаз, который был выявлен с помощью гематоксилина и эосина, периодической кислоты-Шиффа и окрашивания по Ван Гисону. Сосудистые изменения изначально не были четко идентифицированы. Из-за плохого ответа на начатое лечение и подозреваемого плохого прогноза на основании гистопатологических результатов, собака была эвтаназирована. Вскрытие было проведено с информированного согласия владельца. Грубая патология легких показала умеренно разрушенные твердые легкие с диффузным пятнистым видом с многочисленными темными красными очагами размером 1 × 1 × 3 мм и небольшим количеством белых очагов размером 1 × 1 × 1 мм, часто окруженными темной красной зоной (разграничение), распределенной по всем легочным долям (рис. ) Рутинная гистопатология легких показала многоочаговое сосудистое ремоделирование. Для того чтобы отличить мелкие артерии и вены, что важно для диагностики ПОВД, был добавлен дополнительный краситель, визуализирующий эластичные волокна и коллаген (резорцин-фуксин Вейгера), для идентификации эластичных ламелей. У этой собаки, как и у людей с ПОВД, были затронуты все три отдела (артерии, вены и капилляры) легочного микроциркуляции, хотя изменения в легочной венозной системе были наиболее выраженными. Венные поражения включали сильное концентрическое интимальное разрастание, частичное или полное разрушение просвета (рис., ) и постинфарктную реканализацию (рис. с). Капиллярные поражения были организованы в очаги, наиболее очевидные рядом с ремоделированными венулами и характеризовались разрастанием эластичных эндотелиальных клеток (похожих на ПХД) (рис., b, d). Сегментарное задыхание альвеолярных капилляров также регулярно ассоциировалось с очагами ПХД (рис. ) Артериальные поражения напоминали поражения при ПАХ с концентрическим интимальным утолщением за счет увеличения внеклеточного матрикса и медиальной гипертрофии, но сложных плексиформных поражений не было (рис. ) Эти результаты согласуются с результатами, описанными Уильямсом и др. [] и, следовательно, с эквивалентом ПОВД у людей. Геномная ДНК случая была выделена из крови, обработанной ЭДТА, с помощью полуавтоматического экстракционного робота Chemagen (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH) и хранилась при температуре − 20 °C. Приблизительно через 6 лет геномная ДНК случая и не связанная с ним здоровая GSD были проанализированы с помощью полногеномного секвенирования. Целостность ДНК была проверена на биоанализаторе (Agilent, Санта-Клара, США) и количественно определена с помощью Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Уолтхэм, США). Библиотеки ДНК были подготовлены с помощью набора для подготовки библиотеки TruSeq Nano (набор для подготовки библиотеки TruSeq Nano, Illumina, Сан Диего, Калифорния, США) с использованием 200 нг входной гДНК. Информация о полногеномном секвенировании с охватом 30× была получена с помощью прибора HiSeqX Ten (прибор HiSeqX Ten, Illumina, Сан Диего, Калифорния, США) и 2 × 150 парных оснований. Данные обрабатывались с помощью нашей собственной программы v1.2.1 () с анализом соматических мутаций (Strelka, VarScan, FreeBayes и MuTect) и инструментария для анализа генома (GATK v. 3.2.2) [] в соответствии с руководящими принципами передовой практики []. Считывание последовательности было сопоставлено с референтным геномом собак (CanFam 3.1) с помощью выравнивания Burrows-Wheeler с максимальным числом точных совпадений (BWA-MEM) v0.7.5a [], после чего были отмечены дубликаты, объединены полосы и проведено повторное выравнивание интронов. Рекалибровка базы данных не проводилась. В медицине человека мутации в BMPR2, ACVRL1, ENG, KCNK3, CAV-1 и SMAD9 были предложены в качестве причинных факторов для аутосомно-доминантной формы ЛАГ []. Эти гены были включены в анализы для предотвращения пропущенных кандидатов на мутации из-за фенотипической неправильной классификации. Сравнение случаев и контрольных групп показало, что в этих генах выявлено 196 уникальных интронных вариантов. Сравнение последовательности EIF2AK4 в случаях и здоровом GSD показало 124 уникальных варианта, из которых 9 были расположены в 3`-UTR, 112 были интронными и 3 были экзонными вариантами. Случай был гомозиготным мутантом для c.2961T>C и c.1266G>A, гетерозиготная вариация была обнаружена в c.2092G>A. Валидация вариантов была проведена с помощью секвенирования Sanger на амплифицированных продуктах полимеразной цепной реакции из геномной ДНК с использованием Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). После обработки эксонуклеазой I реакции последовательности ДНК были проведены с использованием BigDye v3.1, секвенированы на ABI3130XL и проанализированы в Lasergene (версия 12.0 DNASTAR). Четыре из пяти дополнительных случаев ГСД, неизвестных для любой формы респираторного стресса и в возрасте ≥ 10 лет, показали идентичный генотип, как и в случае, и поэтому были исключены как причинные варианты для PVOD.