4-летний самец евразийской выдры, родившийся в 2015 году в «Сендави, Природный парк Наварры» (42°11′31″N, 1°09′54”O) (северо-восток Испании), был переведен в дикий парк «Терра Натура» (юго-восток Испании) в 2017 году. Дикий парк «Терра Натура» расположен в пригороде Мурсии (38°00′40″N, 1°09′54”O). Вольер для выдр состоял из участка с вольерами и прудом, в котором находилось 4 животных этого вида (2 самца и 2 самки). На выдр не наносили наружный противомоскитный инсектицид. В августе 2019 года у животного наблюдался двусторонний эпистаксис, анорексия, апатия и потеря веса (рисунок). Животное было седативно перед манипуляцией с помощью медитомидина (0,2 мг/кг/м.м.) и кетамина (20 мг/кг/м.м.). Полная кровь была взята венопункцией из цефальной вены, слита в 1 мл-ную пробирку, покрытую этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), и 1 мл-ную пробирку без антикоагулянта для полного подсчета клеток крови (ПКК) и биохимического анализа соответственно. ПКК был проведен в счетчике клеток крови (ADVIA 120 Hematology System, Siemens, Италия), а биохимический анализ был проведен в автоматическом биохимическом анализаторе (Olympus AU600 Automatic Chemistry Analyzer, Olympus Europe GmbH, Hamburg, Germany). Кроме того, моча была взята ультразвуковым прощупыванием мочевого пузыря для анализа мочи. Было проведено эхографическое исследование сердца и брюшной полости, включая почки, селезенку, печень, желчный пузырь, поджелудочную железу и пищеварительную систему. Поскольку биохимические и эхографические результаты были совместимы с клиническим лейшманиозом, были проведены серологические и молекулярные тесты для подтверждения наличия инфекции. Присутствие антител IgG2 против лейшмании было оценено в сыворотке выдры с помощью иммунофлуоресцентного анализа с временным разрешением (TR-IFMA), проведенного в соответствии с описанием Cantos-Barreda et al. []. Для проверки того, что TR-IFMA-анализ, валидированный для сыворотки собак, может быть применен к сыворотке выдры, был проведен анализ Western blot. Western blot был проведен в сыворотке выдры с признаками, совместимыми с лейшманиозом, и в сыворотке собаки, серопозитивной на лейшманию, с помощью TR-IFMA. Сыворотки (разбавление 1:2000) были разделены в условиях уменьшения на мини-полиакриламидные гели (0,1% натрия додецилсульфата (SDS), 12% резорбирующего геля и 4% геля-стабилизатора). Резолютивные белки были электрофоретически перенесены на лист нитроцеллюлозы (Bio-Rad, США) и помещены в субстрат ROTI®Lumin (Carl Roth, Германия) для блокирования в течение 2 часов при комнатной температуре. Поликлональное антитело анти-собачье IgG2 (AHP498; Bio-Rad, США) при разведении 1:1000 было использовано в качестве первичного антитела, в то время как анти-овечье IgG-пероксидаза-конъюгированная антитело кролика (HRP) (SAB3700702; Sigma-Aldrich, США) при разведении 1:1000 была использована в качестве вторичного антитела для обнаружения связанного первичного антитела. Детектирование сигнала было сделано с помощью комплекта Pierce ECL2 (Pierce, Thermo Fisher Scientific, США) и было оцифровано в сканере Typhoon 9410 (GE Healthcare, США). Была обнаружена полоса приблизительно 150 кДа как в пробах выдры, так и в пробах собаки (см. фиг. и дополнительный файл). Эти результаты подтвердили, что TR-IFMA-анализ с использованием анти-собачьего IgG2 антитела у выдры смог обнаружить IgG2 выдры. TR-IFMA-анализ состоял из неконкурентного непрямого метода, основанного на биотинилированном рекомбинантном антигене K39 в качестве реагента захвата, и анти-собачьего IgG2 поликлонального антитела (Sheep anti-Dog IgG2, Bio-Rad, США) Eu3 +-меченого в качестве детектора. Тест включал сыворотку от больной собаки, серопозитивной на лейшманиоз, как положительный контроль, и сыворотку от здоровой собаки, серонегативной на лейшманиоз, как отрицательный контроль. Анализ был проведен в многоэлементном счетчике (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Финляндия). Результаты были выражены в единицах флуорометрии для лейшмании (UFL). Предел был установлен на уровне 22 UFL. Также был проведен анализ на основе иммуноферментного анализа (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Барселона, Испания), выявляющий специфические антитела IgG против лейшмании. Сыворотки были разбавлены в соотношении 1:20, и результаты были выражены в виде соотношения S/P, рассчитанного как оптическая плотность (OD) пробы/OD низкой положительной пробы. Значения S/P выше 1,1 были признаны положительными. Присутствие ДНК Leishmania spp. в цельной крови и костном мозге оценивалось с помощью амплификации последовательности ДНК кинетопластов Leishmania spp. с использованием rtPCR с праймерами и зондами, описанными ранее []. Костный мозг был получен с помощью тонкой иглы в костно-ключичном сочленении и собран в 1 мл-ную пробирку, покрытую EDTA. ДНК была экстрагирована с помощью набора для приготовления высокочистой рц-ПЦР-праймера (Roche, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Рц-ПЦР была проведена в системе количественного анализа в режиме реального времени QuantStudio 5 (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Был включен внутренний контроль TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, США). Рц-ПЦР была проведена в конечном объеме 20 мкл, включая 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, США), 900 нМ каждого праймера, 200 нМ зонда TaqMan, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC ДНК и 50 нм ДНК из каждого пробы. Параметры цикла были следующими: 50 °C в течение 30 секунд, 95 °C в течение 10 минут, 45 циклов при 94 °C в течение 30 секунд и 55 °C в течение 1 минуты. Каждый цикл амплификации включал положительные и отрицательные контрольные пробы, а каждое измерение было выполнено в три раза. Для идентификации видов Leishmania продукты PCR из положительных проб были очищены с помощью набора для очистки высокочистой рц-продукции (Roche, Германия) и представлены для секвенирования в отделе молекулярной биологии Университета Мурсии. Полученные последовательности были сравнены с доступными в GenBank. Кроме того, в качестве отрицательного контроля, те же анализы были проведены на 3-летней самке евразийской выдры из того же парка дикой природы без клинических признаков, совместимых с лейшманиозом. Все результаты представлены в Таблице. Было подтверждено наличие лейшманиоза, и был назначен специфический курс лечения (аллопуринол 15 мг/кг/24 ч/перорально). В ноябре 2019 года, после 3 месяцев лечения, был проведен мониторинг лечения. Были отмечены двусторонние нефропатии с гидронефрозом, мезентериальная лимфаденомегалия и асцит. В общем анализе крови у лейошманиозависимого видре было обнаружено снижение лейкоцитов и тромбоцитов. Биохимический профиль сыворотки крови у лейошманиозависимого видре показал гиперпротеинемию, гиперглобулинемию, снижение ПОН-1 и повышение гаптоглобина и ферритина. Уринограмма показала протеинурию и снижение осмолярности и удельного веса. Было отмечено наличие анти-лейшманиозных антител IgG2 и положительный результат ПЦР в режиме реального времени в цельной крови и костном мозге у лейошманиозависимого видре. Последовательность положительных проб подтвердила идентификацию L. infantum. Усиленная последовательность показала 100% сходство с референтной последовательностью L. infantum. Кроме того, в цитологии селезенки были обнаружены овальные микроорганизмы с эксцентричным ядром, совместимым с амебоцитами Leishmania spp. (рисунок).