52-летняя женщина с историей холецистэктомии и частичной резекции левой части печени в 2004 году из-за симптоматического желчного камня и множественных внутрипеченочных желчных ходов имела периодическую лихорадку и прогрессирующую желтуху с начала ноября 2014 года. Были обнаружены препятствия в желчных ходах и подозрение на злокачественное образование в области печени. Были проведены последующие ультрасонография, магнитно-резонансная холангиопанкреатография (МРХПГ), магнитно-резонансная томография (МРТ) и позитронно-эмиссионная томография с компьютерной томографией (ПЭТ-КТ) (фиг. ). В конце ноября 2014 года была проведена обследовательская лапаротомия (дополнительный файл: фигура S1) и обнаружены тяжелые внутрибрюшинные спайки, узел (1 × 2 см) с уплотненной текстурой в проксимальном левом желчном протоке и распространенные неопластические поражения, инфильтрирующие узел общей печени, гепатодуоденальную связку, окружающие лимфатические узлы, артерию печени, портальную вену и аорту. Эти результаты заставили хирургов отказаться от радикальной резекции. Из желчного протока была выделена гнойная слизь, а из стенки желчного протока выступал сливовый протуберанец. Были удалены частичные неопластические поражения из увеличенных лимфатических узлов, узел левой части печени и края общей артерии печени для патологоанатомического исследования. Был установлен дренаж желчного протока для облегчения желчной обструкции. В результате патологоанатомического исследования было установлено, что природа опухоли была слабо дифференцированной аденокарциномой с дифференцированными маркерами холангиоцитов; кроме того, была обнаружена умеренная экспрессия EGFR в >90% опухолевых клеток. Эта пациентка была, наконец, диагностирована как имеющая неоперабельную перихилярную CCA. Через пять недель после паллиативной операции пациентка получила 4-недельный курс ТОМО-терапии на опухоль в области общего желчного протока (DT = 60 Gy/25 F), один цикл систематической химиотерапии с паклитакселом, связанным с альбумином, для ее непереносимой желудочно-кишечной токсичности и инфузии аутологичных цитокин-индуцированных клеток. Из-за прогрессивного увеличения CA199, ПЭТ-КТ был повторно обследован сразу после завершения радиотерапии и показал новую метастатическую гиперметаболическую лезию в области левой части печени и увеличенные мягкие ткани и метастазы в портальной вене и селезенке с аномальным стандартным значением (SUV) между печенью и желудком по сравнению с ПЭТ-КТ до радиотерапии (фиг. ). Через четыре недели после радиотерапии пациентка была включена в исследование CART-EGFR. Ее функциональное состояние было 1 в соответствии с критериями Восточно-кооперативной онкологической группы (ECOG). Во время подготовки к CART-EGFR-клеткам у пациентки развилась высокая температура, агрессивная желтуха и обструкция желчных ходов, сопровождаемая постоянным повышением CA199 (от 100,5 до 413,5 U/ml), агрессивным повышением общего билирубина, прямого билирубина и других связанных с желчными ходами энзимологических маркеров, и она была лечена эффективными широкоспектральными антибиотиками и эндоскопическим стентом в желчных протоках печени. Исследования (идентификаторы ClinicalTrials.gov NCT01869166, NCT02541370) были одобрены Институциональным советом по обзору при Главном госпитале китайской Народно-освободительной армии. В исследованиях не участвовал коммерческий спонсор. Записанные пациенты дали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинской декларацией. Последовательность ДНК одноцепочечного фрагмента вариабельной области (scFv), нацеленного на антиген EGFR, была получена из JQ306330.1 (номер в GenBank). Анти-EGFR scFv-CD137-CD3zeta CAR был получен и клонирован в лентивирусный каркас pWPT, подробно описанный Feng et al. []. Конструкция была проверена методом секвенирования ДНК. Псевдотипированный клинический лентивирусный вектор был получен стандартной трансфекцией, как описано McGinley et al. [ ] Согласно инструкции производителя для реагента для трансфекции Lipofectamine 3000 (Invitrogen, США), плазмида pWPT-anti-EGFR CAR, плазмида ps-PAX2 и плазмида оболочки pMD2.G были трансфецированы в клетки 293 T. Лентивирусные супернатанты были собраны и сохранены при температуре −80 °C. Вектор GFP-CD137-CD3zeta был сконструирован для проверки эффективности трансдукции с помощью проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences). Последовательность ДНК scFv, нацеленная на антиген CD133, была получена из HW350341.1 (номер в GenBank), а генерация, конструкция и тестирование CAR133 T-клеток проходили по той же процедуре, что и CART-EGFR-клеток (Дополнительный файл: Рисунок S2). Клетки CART были изготовлены из аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), собранных в пробирках для приготовления клеток (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), очищенных от 80 до 100 мл цельной крови в Центре надлежащей производственной практики Главного госпиталя НОАК в соответствии с текущими стандартными операционными процедурами. PBMC стимулировали анти-CD3 MoAb в концентрации 50 нг/мл (Takara, Япония) и рекомбинантным человеческим интерлейкином-2 в концентрации 500 U/ml (Peprotech, США) в среде GT-T551 (Takara). Лентивирусное трансдуцирование осуществлялось в среде GT-T551 с протаминовым сульфатом (Sigma) в течение 24 часов после 2 дней культивирования Т-клеток. После этого клетки были дополнительно расширены в культуральных пакетах (Takara) и собраны в виде клеток CART. Перед инфузией клеток CART были проверены бактерии, грибки и эндотоксин. Иммунофенотип клеток CART был проанализирован с помощью проточной цитометрии с флуоресцентно помеченными антителами, специфичными для окрашивания CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L и CCR7. Для контроля окрашивания использовались моноклональные антитела, соответствующие по изотопу (BD Biosciences). Экспрессия CAR была оценена на основе GFP-CD137-CD3zeta-трансдуцированных клеток в одной партии для всех пациентов с помощью проточной цитометрии. Сбор и анализ данных были выполнены с помощью проточной цитометрии FACSCalibur (BD Biosciences). В пробирке цитотоксичность клеток CART-EGFR была проверена путем совместного культивирования с EGFR-положительными опухолевыми клетками при различных соотношениях эффектора к мишени в 96-луночных планшетах с использованием 4-часового набора для детекции CCK-8 (DOJINDO, Япония). Для оценки уровня гена слияния CAR использовался количественный ПЦР в режиме реального времени (Q-PCR) в соответствии с ранее описанным протоколом.13 Фрагмент 153-bp (базовых пар), который содержит части цепи CD8a и соседней цепи 4-1BB (5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ и 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′), был амплифицирован системой обнаружения последовательностей ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Бета-актин использовался в качестве внутреннего контроля. Была подготовлена стандартная кривая в 7 точек, которая состояла из плазмидных ДНК с содержанием гена CAR от 100 до 108 копий/мкл. С помощью микросфер BD Biosciences для сэндвич-иммуноанализа и в соответствии с инструкциями изготовителя были проверены сывороточные уровни IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF и гранзима B. Согласно системе культивирования, как сообщалось ранее [], клетки CART-EGFR были получены из мононуклеарных клеток 80-100 мл периферической крови пациента и выпущены для инфузий. Из инфузированных клеток во время первого цикла терапии CART-EGFR 99,14% были CD3+ клетками, в основном состоящими из подмножества CD8+ (62,26%), а 23,61% были охарактеризованы как центральный фенотип памяти (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Кроме того, 8,99% инфузированных клеток были EGFR-положительными. Фенотип и эффективность трансфекции инфузированных клеток CART-EGFR в каждом цикле документированы в таблице. Клетки CART133 были получены и культивированы в соответствии с той же процедурой, что и клетки CART-EGFR. Из введенных клеток 95,2% были CD3+ клетками, в основном состоящими из подмножества CD8+ (71,9%), а 41,9% были подмножеством CD45RO+/CD62L+/CCR7+. Кроме того, 6,4% введенных клеток были CD133-положительными. Подробности представлены в таблице. Поскольку пациентка недавно прошла курс радиотерапии в течение 2 месяцев и не переносила химиотерапевтические препараты, ей были введены 4-дневные последовательные инфузии 2,2 × 106/кг клеток CART-EGFR в общей сложности без предварительной подготовки, и она достигла PR в своей первой оценке через 6 недель, оцененной в соответствии с критериями оценки ответа на солидные опухоли версии 1.1 (RECIST 1.1) с помощью МРТ и ПЭТ-КТ, что продемонстрировало более чем 80% уменьшение метастатических поражений в области печени и хвостатой доли и значительное снижение SUV (рис. ), а также быстрое снижение СА199 с 413,5 до 123,1 U/ml (рис. ). Число копий CAR-трансгена в периферической крови пациентки достигло пика в 5916 пг/дл на 9-й день, сопровождавшегося высвобождением цитокинов, таких как интерлейкин-6 (IL-6) и С-реактивный белок (CRP) (рис. и ). Второй цикл монотерапии CART-EGFR был введен с дозой EGFR-CAR+ экспрессирующих Т-клеток 2,1 × 106/кг и без предварительной подготовки, поскольку число копий CAR-трансгена в периферической крови снизилось до уровня базовой линии через 2 месяца после первой инфузии генетически модифицированных Т-клеток CART-EGFR. Рутинные обследования МРТ и ПЭТ-КТ показали устойчивый статус PR, сопровождавшийся дальнейшим снижением СА199 до 61,2 U/ml (рис. и ). Интересно, что пик числа копий CAR-трансгена после второй инфузии клеток CART-EGFR не достиг уровня, аналогичного или более высокого, чем после первой инфузии CART-EGFR (рис. ). Статус PR пациентки сохранялся в течение 8,5 месяцев, пока у нее не развилось частое неконтролируемое рвота, тупая боль в верхней части живота и желудочно-кишечная рефлюксная болезнь, которые произошли в середине ноября 2015 года. Последующее электронное гастроскопическое обследование показало стриктуру дуоденального bulb, а ПЭТ-КТ подтвердил прогрессирование опухоли с иллюстрацией нескольких новых аномальных поражений SUV в оментуме майусе, брюшной полости и брюшной полости (рис. ). Впоследствии пациенту был назначен 1 цикл терапии CART-EGFR в сочетании с 2 циклами анти-программированной клеточной смерти белка 1 (PD-1) моноклональным антителом (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), который вводился в дозе 100 мг каждые 2 недели. Аналогично, количество копий CAR-трансгена, контролируемое в периферической крови, не достигло аналогичного пикового уровня первой инфузии цикла даже в сочетании с анти-PD-1 антителом (рис. ). Несмотря на то, что сывороточный CA199 временно снизился с 326,3 до 210,8 U/ml (рис. ), следующий ПЭТ-КТ обнаружил новые метастазы в нижней части таза, правом левом и левом надключичном лимфатическом узле, а также увеличение предыдущих опухолевых поражений в брюшной полости по сравнению с ПЭТ-КТ до комбинированной иммунотерапии (рис. и). Поскольку более 90% опухолевых клеток экспрессировали белок CD133 (дополнительный файл: рисунок S3), пациентка была включена в исследование CART133 и получила инфузию 1,22 × 106/кг CART-клеток, специфичных к CD133, без предварительной подготовки. Из-за появления обструкции в нисходящем отделе двенадцатиперстной кишки и возникшей в результате этого персистирующей тяжелой инфекции желчевыводящих путей, а также абсцесса печени, которые могли помешать уровню сывороточного CA199 и были обработаны антибиотиками, запланированная оценка визуализации была отложена до 2 месяцев после инфузии CART133 клеток, в которой контрастная КТ показала заметное уменьшение или даже исчезновение некоторых метастазов в брюшной полости и брюшной полости, что привело к оценке PR (рисунок). Число копий CAR-трансгена в периферической крови (PB) колебалось от 377 до 919 пг/дл (рисунок). Пациентка почувствовала постоянную тупую боль в верхней части живота через 2,5 месяца, а последующее КТ показало приблизительно 40 × 70 мм новую метастатическую лезию под брюшной стенкой и подозреваемые метастазы в брюшной полости, сопровождавшиеся уменьшением числа копий CAR-трансгена в PB до уровня, близкого к исходному, что привело к заключению о прогрессирующем заболевании (PD) (рисунок). Неблагоприятные явления, такие как озноб, лихорадка, усталость, рвота и мышечные боли, возникающие во время инфузии клеток CART-EGFR, были обычно мягкими, терпимыми и поддавались лечению поддерживающей терапией. Однако у пациентки развилась 9-дневная низкая температура без озноба, кашля, диареи или каких-либо других инфекционных симптомов с третьего дня после инфузии клеток CART. Повторное лабораторное обследование периферической крови показало нормальное количество белых клеток крови, соотношение нейтрофилов, отрицательный прокальцитонин (PCT) и отрицательные посевы крови, которые не поддерживали диагноз инфекции, но одновременно с этим наблюдалось повышение уровня IL-6 и CRP (рис. ) и острое повышение уровня глутамино-пировиноградной трансаминазы и глутамино-оксалацетической трансаминазы (>6ULN). Через 2 недели после инфузии клеток CART-EGFR в левой части бедра появились несколько рассеянных мелких высыпаний, которые постепенно ухудшались и становились очевидными и зудящими с появлением многочисленных чешуйчатых или линейных высыпаний, распространяющихся от левой части бедра до икроножной мышцы и сливающихся вместе, что было оценено как 2 степени согласно общей терминологической классификации нежелательных явлений 4.0 (CTCAE 4.0), когда был завершен второй цикл иммунотерапии CART. Высыпания были проанализированы биопсией с иллюстрацией патологических изменений, таких как потеря части эпидермиса, вакуолярная дегенерация базальных клеток и инфильтрация многочисленных Т-лимфоцитов в эпидермис и его придатки (рис. ), и успешно лечились мазью с такролимусом. Во время лечения CART-EGFR не наблюдалось гипотензии. За исключением легкой тошноты, рвоты, озноба, лихорадки и усталости, в ходе комбинированного лечения не было никаких других острых нежелательных событий. Хотя перхоть появилась и ухудшилась после комбинированной иммунотерапии, она не требовала медицинского вмешательства. Уровни цитокинов в сыворотке, таких как фактор некроза опухоли-α (TNF-α), IL-6 и CRP, немного повысились и не вызывали никаких симптомов высвобождения цитокинов. Во время инфузии последовательно увеличивающихся доз клеток CART133 в течение 4 дней не было никаких других побочных эффектов, кроме связанных с инфузией умеренной лихорадки и усталости. Однако на следующее утро после завершения инфузии клеток CART133 у этой пациентки развилась прерывистая верхняя абдоминальная тупая боль, озноб, лихорадка (39,1 °C), спорадические точечные кровоизлияния и застойные высыпания на ее икроножных мышцах, которые быстро и диффузно распространились на ее шею, правую верхнюю руку, грудь, левый живот и ретрофарингеальную слизистую оболочку, сопровождавшиеся зудом и диареей в тот же день, а также ухудшились в течение следующих 10 дней (рис. ). Побочные эффекты кожи и подкожных тканей были оценены по 3 степени в соответствии с CTCAE 4.0. Серийное тестирование сывороточных цитокинов выявило быстрое повышение уровня TNF-α, IL-6 и CRP (рис. ). Энтанцерпепт, слитый белок, который действует как ингибитор TNF, внутривенный метилпреднизолон и гамма-глобулин были успешно введены немедленно и обратили токсические эффекты на коже/слизистой оболочке. Использование CAR-модифицированных Т-клеток для уничтожения рака изучалось в течение более 20 лет, и недавно CART19 дала многообещающие результаты в лечении гематологических злокачественных опухолей, экспрессирующих CD19. Однако, как перевести этот захватывающий успех CART-терапии на лечение солидных опухолей, оставалось неясным, что требовало лучшего понимания потенциальных терапевтических барьеров, включая факторы, регулирующие экспансию CART-клеток, их устойчивость и трафик in vivo, микроокружение опухоли и его взаимодействие с опухолевыми клетками, а также стволовые клетки рака, а также кондиционирующие терапии. Поскольку Портер и др. отметили, что энергичная экспансия и устойчивость клеток CART in vivo является критическим фактором терапевтической эффективности [], в этом случае число копий CAR-трансгена в PB увеличилось до пикового уровня сразу после начала инфузии клеток CART-EGFR, что иллюстрирует, что клетки CART-EGFR подвергались сильной экспансии in vivo, что является одним из предпосылок для того, чтобы клетки CART-EGFR уничтожали клетки CCA, экспрессирующие EGFR. Кроме того, устойчивость клеток CART in vivo, несмотря на ряд возможных факторов, влияющих на лечение, таких как аффинность CAR к мишени, иммуногенность CAR и факторы, обусловленные хозяином, как было предложено, непосредственно коррелирует с более длительным временем до прогрессии []. Этот пациент был пролечен вторым циклом инфузии клеток CART-EGFR, как только число копий CAR-трансгена в PB снизилось до уровня, близкого к исходному, через 8 недель после инфузии первого цикла, что позволило клеткам CART эффективно сохраняться in vivo более 24 недель, а статус пациента PR сохранялся в течение 8,5 месяцев, что может предполагать, что повторные инфузии клеток CART могли способствовать продлению их persistence in vivo и обеспечению более длительной выживаемости без прогрессии в условиях, когда целевая опухоль реагировала на клетки CART-EGFR. Тем временем, мы также обнаружили, что число копий CAR-трансгена последующих циклов инфузии клеток CART не могло достичь параллельного или более высокого пика, даже в сочетании с анти-PD-1 антителом, по сравнению с первым циклом, что указывает на ослабление экспансии клеток CART in vivo и потерю клеток CART. Один из потенциальных механизмов заключается в том, что муринское scFv, включенное в CAR-трансген, может привести к развитию иммунитета CD8+ T-клеток []. Последняя функциональная компетенция клеток CART в солидных опухолях определяется тем, могут ли они эффективно проникать в микроокружение опухоли, сложную и плотную сеть фиброзной матрицы, которая управляется как злокачественными, так и незлокачественными клетками, в которой инфильтрированные клетки CART могут быть ингибированы иммуносупрессивными клетками и молекулами, такими как Tregs, миелоидные супрессорные клетки (MDSC) и лиганд белка программируемой клеточной смерти 1 (PD-L1) [,], что приводит к быстрой потере их способности к цитолитической и цитокиновой секреции и к состоянию гипореактивности []. Кроме того, солидные опухоли часто демонстрируют метаболические отклонения, потребляя ключевые аминокислоты, которые имеют решающее значение для активности Т-клеток, и вызывают гипоксию и в результате кислотность внеклеточного матрикса из-за недостаточного кровоснабжения, которое является неблагоприятным для выживания Т-клеток []. Таким образом, для улучшения результатов необходимо регулировать микроокружение опухоли. В этом случае, несмотря на то, что пациентка не получала никакого прямого кондиционирующего лечения с целью преобразования микроокружения опухоли, она была лечена 60 Гр радиотерапией с интервалом примерно в 1 месяц от конца радиотерапии до начала инфузии клеток CART. Хотя сама радиотерапия не смогла эффективно уничтожить опухолевые клетки, ее прямой и отсроченный эффект может играть роль в разрушении поддерживающей опухоль стромы, изменении биологии микроокружения опухоли, содействии высвобождению большего количества опухолевых антигенов и усилении иммунного распознавания []. Кроме того, радиотерапия может сделать опухоли более иммуногенными и более восприимчивыми к улучшенному нападению иммунных клеток [], и даже генерировать антиопухолевые эффекты в тех отдаленных метастазах, которые не были локально облучены (называемые абсцолярным эффектом) [, ]. Таким образом, мы выдвигаем гипотезу, что радиотерапия может быть разумной и эффективной кондиционирующей терапией для улучшения результатов CART-терапии. Когда было подтверждено, что резистентность к CART-EGFR терапии существует, мы однажды попробовали комбинацию иммунотерапии анти-PD-1 антителом в сочетании с инфузией CART-EGFR клеток на основе доклинического исследования, что блокада иммуносупрессии PD-1 может значительно повысить терапевтическую эффективность CART клеточной терапии против установленных солидных опухолей []. К сожалению, это лечение закончилось неудачей, когда PET-CT подтвердил прогрессию заболевания, хотя CA199 был временно уменьшен. Одним из возможных объяснений является неясный уровень экспрессии PD-L1. Недавно экспрессия PD-L1 была выделена для ее значения в прогнозировании терапевтического эффекта анти-PD-1 препаратов. Однако опухолевое поражение в этом случае было труднодоступным для биопсии из-за его анатомического расположения, в результате чего уровень экспрессии белка PD-L1 на опухолевых клетках не мог быть точно обнаружен до начала анти-PD-1 терапии, что существует вероятность того, что экспрессия PD-L1 в опухолевой среде может быть низким уровнем или даже отрицательным и, следовательно, привести к неудаче анти-PD-1 лечения. Между тем, было много других параллельных контрольных точек, которые могли потенциально поддерживать резистентность к анти-PD-1 терапии [] При этой ситуации, выбор рациональной мишени был решающим для следующего шага лечения пациентов. Недавно CSCs в CCA привлекли большое внимание своими высоко канцерогенными свойствами и ключевыми ролями в опосредовании самообновления, повторного роста опухоли и терапевтической резистентности, следовательно, терапия, которая была нацелена на поверхностные молекулярные маркеры и сигнальные пути, специфичные для CSC, была бы возможным мощным вариантом для CCA [, ]. Среди молекул, используемых индивидуально или в комбинации для идентификации холангиокарциномных стволовых клеток, CD133 является одним из наиболее важных стволовых клеточных маркеров, которые связаны с более высокой инвазивностью и более плохим прогнозом [] Shien и коллеги также сообщили, что CD133-положительные опухолевые клетки показали большую резистентность к послеоперационному лечению, чем CD133 отрицательные клетки, и наблюдалось увеличение экспрессии CD133 в остаточных раковых клетках после адъювантной терапии [] На основе вышесказанного, мы, наконец, выбрали CD133 в качестве целевого антигена для CART иммунотерапии, которая, в свою очередь, произвела еще один частичный ответ, и продемонстрировала, что CART коктейль иммунотерапия может быть осуществимой и рациональной. Другой важной проблемой была токсичность, которая могла быть вызвана CART-клетками на опухолевых антигенах, экспрессируемых на опухолевых и/или одновременно на нормальных тканях, что называется эффектом на опухоль и за ее пределами. Повреждение нормальных тканей могло даже произойти из-за неожиданной перекрестной реакции с белком, который не экспрессируется на опухолевых клетках. [] С момента начала инфузии CART-EGFR-клеток у этого пациента наблюдались не только лихорадка, озноб и усталость, связанные с инфузией, но и устойчивая лихорадка, резкое повышение уровня сывороточных трансаминаз и отсроченное появление кожных высыпаний, сопровождавшихся резким повышением числа копий CAR-трангена, IL-6 и CRP, хотя их уровни не соответствовали критериям диагностики синдрома высвобождения цитокинов [, ]. Массивные цитокины, которые могли быть непосредственно продуцированы инфузированными CART-клетками, отражали сильную иммунную реакцию, которая могла генерировать как противоопухолевые эффекты на опухолевых клетках, так и побочные эффекты на нормальных тканях. Кроме того, эффект на опухоль и за ее пределами, вызванный CART-EGFR-клетками, вероятно, был причиной появления дермальной токсичности из-за распределения EGFR на эпидермисе. [] Однако все эти неблагоприятные события были мягкими, обратимыми и контролировались поддерживающей терапией и местным кортикостероидом. Добавление анти-PD-1 антитела, по-видимому, не усугубило токсичность CART-EGFR иммунотерапии в этом случае. Тем не менее, в последующем лечении инфузией клеток CART133 этот пациент страдал от тяжелой дермальной, оральной слизистой и желудочно-кишечной токсичности, такой как конгестивное высыпание и кровоизлияние. Хотя эти токсичности были успешно контролированы экстренными медицинскими вмешательствами, включая внутривенное введение метилпреднизолона и ингибитора анти-TNF, их внутренний механизм, вероятно, в значительной степени был обусловлен эффектом на опухоль и за ее пределами CART133-клеток, которые были нацелены на антиген CD133, экспрессируемый на нормальном эпителии и сосудистом эндотелии. Кроме того, было неясно, могли ли анти-PD-1 антитела и остаточные CART-EGFR-клетки in vivo играть роль в ухудшении токсичности CART133-иммунотерапии.