В 1996 году у 47-летней женщины (вес: 62 кг) был диагностирован хронический активный гепатит В с положительным HBeAg. Вирусные параметры, такие как HBeAg, анти-HBe IgG и вирусная нагрузка HBV в плазме из замороженных проб, были одновременно измерены уникальным оператором для уменьшения внутри- и меж-анализных вариаций. HBeAg и анти-HBe были определены электрохимической люминесценцией (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). Уровни вирусной нагрузки HBV были определены с помощью ПЦР в реальном времени (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, динамический диапазон 30 IU/ml до 110 000 000 IU/ml) []. Воспаление печени было измерено уровнями аланинаминотрансферазы в сыворотке крови (ALT). Для анализа последовательности HBV поли и пре-С-ядерные гены были последовательно секвенированы с праймерами, как описано ранее []. Анализ был выполнен с помощью прибора ABI3100 (Applied Biosystems), а последовательности, введенные в эту работу, а также полученные из базы данных GenBank, были выровнены с помощью ClustalX v1.83 [] и отредактированы с помощью Bioedit v7.0.9.0 [] Гентип HBV был оценен с помощью филогенетического вывода с использованием алгоритма соседних связей с двухпараметрической моделью молекулярной эволюции Кимура в программном обеспечении MEGA v3.1 [] Последовательности обоих генов были получены в разные моменты времени во время противовирусной терапии (рисунок). Более подробный анализ клонального полигена HBV был проведен на семи выбранных вирусных изолятах из проб сыворотки, собранных во время последовательных терапий. Каждый выбранный продукт полигена был клонирован в вектор pGEM-T Easy в соответствии с инструкциями производителя (Promega, Висконсин, США), и по меньшей мере 15 клонов были дополнительно проанализированы методом секвенирования. Это позволило проанализировать эволюцию вирусных квазипопуляций под последовательным противовирусным давлением на основе анализа полигена. Варианты лечения анти-HBV сопровождались кинетикой вирусного уровня HBV и ALT, как показано на рисунке. Терапия была начата, когда вирусный уровень HBV поднялся до 6,5 × 106 IU/ml. В 1998 году, когда пациент получал IFN-альфа 5 MU три раза в неделю в течение 30 недель, уровень ДНК HBV был ниже предела обнаружения. Терапия была прервана и заменена в 1999 году ламивудином (150 мг один раз в день). После 2 лет непрерывного лечения уровень ДНК HBV был обнаружен (15,5 × 106 IU/ml). HBeAg оставался отрицательным с обнаруживаемыми анти-HBe в течение этого периода лечения. В 2001 году, после 6-месячного перерыва, уровень ДНК HBV продемонстрировал вспышку после лечения (1 × 108 IU/ml). В конце 2003 года терапия ламивудином была вновь введена (150 мг один раз в день). Она сопровождалась редким событием реверсии к HBeAg-положительному/анти-HBe-отрицательному профилю, который оставался обнаруживаемым в течение двух лет. Вирусный уровень достиг 3,1 × 106 IU/ml в этот момент. Десять месяцев спустя, в 2006 году, режим лечения ламивудином был заменен монотерапией адефовиром (10 мг/день). Первоначально уровни вирусной нагрузки были низкими (8,5 × 104 IU/ml), но после 48 недель терапии эти уровни достигли 7,15 × 106 IU/ml. Уровни ALT были нормальными в течение этого интервала. Реактивация репликации HBV была предположена, учитывая одновременное обнаружение HBeAg/анти-HBe [] и высокую репликацию. Сопутствующее обнаружение HBeAg и анти-HBe не является необычным среди пациентов, ранее не получавших противовирусной терапии, но его распространенность среди пациентов, ранее получавших терапию, неизвестна. Этот серологический паттерн был связан с обширным повреждением гепатоцитов и тяжелым иммунно-опосредованным повреждением печени и последующей дисфункцией []. Шесть месяцев спустя уровень ALT немного повысился (1,5 × верхний нормальный предел - UNL -), и была начата монотерапия энтекавиром (1 мг ежедневно). После 5-месячной монотерапии энтекавиром к режиму двойной терапии был добавлен тенофовир (300 мг один раз в день). HBV ДНК снизилась до 1 × 105 IU/ml в течение четырех месяцев, но три месяца спустя вирусная нагрузка достигла > 1.1 × 108 IU/ml. Кроме того, повышение уровня АЛТ (20× УНЛ) указывало на воспаление печени. В течение следующих 48 недель вирусная репликация немного снизилась до 6.1 × 106 IU/ml, но восстановилась сначала до 3.6 × 107 IU/ml, а затем до > 1.1 × 108 IU/ml. В последнее время (вторая половина 2010 года) уровни HBV ДНК колебались в пределах от 4.3 × 104 IU/ml до 4.9 × 107 IU/ml. К концу наблюдения за исследованием мы смогли измерить концентрацию тенофовира в плазме с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в трех последовательных пробах через 20 часов после приема, достигнув 71.6 ng/ml ± 47.6 (среднее значение ± SD). Уровни ALT-AST оставались немного повышенными (2× UNL) в течение последних двух лет наблюдения. HBV изоляты от пациента были отнесены к генотипу A2 на основании филогенетической близости между частичными геномными последовательностями HBV из обоих генов pol и preC-C. Дальнейший продольный генотипический анализ, включая квази-состав штаммов HBV, изолированных от пациента, выявил наличие резистентных мутаций на основе последовательностей гена pol (таблица). В начале лечения ламивудином HBV был дикого типа во всех клонах. После 2 лет такой терапии эта вирусная популяция была полностью заменена мутацией rtM204I, которая демонстрирует резистентность к ламивудину. Когда такое лечение было прервано на 6 месяцев, квази-состав состоял почти исключительно из нуклеотидных последовательностей дикого типа, за исключением незначительного вклада (< 10%), демонстрирующего мутацию I233V, связанную с резистентностью к адефовиру. После повторного введения ламивудина и до введения энтекавира плюс тенофовира, двойные мутации rtL180M и rtM204I, связанные с резистентностью к ламивудину, неизменно выявлялись. При последнем терапевтическом режиме только эпизодически и с незначительным вкладом (< 10%) выявлялись мутации A181T и T184L, связанные с резистентностью к ламивудину и энтекавиру. Кроме того, в каталитическом домене обратной транскриптазы были обнаружены еще два варианта на момент появления резистентности к ламивудину. Эти варианты rtA200V и rtI253V оставались присутствующими во время терапии энтекавиром и были также обнаружены в пробах, секвенированных после появления резистентности во время терапии энтекавиром. Геномная характеристика HBV на уровне preC-C показала наличие двойной мутации A1762T и G1764A, которая была обнаружена на раннем этапе, когда пациент не получал лечения, и оставалась в этом состоянии на протяжении всего периода наблюдения. Мутация T1753C также была обнаружена. Наличие этих мутаций основного промотора также связано с вышеупомянутым параллельным профилем HBeAg-antiHBe, обнаруженным у этого пациента, как недавно сообщалось [].