73-летний пациент был направлен к специалисту по общей стоматологии для дальнейшей оценки беловатого поражения на прикрепленной десне и связанного с ним периодонтита. Панорамный снимок показывает генерализованную атрофию альвеолярной кости и отложения камней в области периодонта (№42, №43, №44), а также периодонтальное костное поражение в области правого нижнего резца и премоляра. Результаты лабораторных исследований были в пределах нормы. Были исключены другие ситуации, связанные с повышением уровня онкогенных белков, включая употребление табака и/или алкоголя, отсутствие дефицита питательных веществ, отсутствие данных об облучении ионизирующей радиацией, отсутствие иммунодефицита или иммунодепрессантов и другие раздражения от съемных протезов. Беловатое поражение было удалено, а образец был отправлен в устный патолог. Поверхность загрязненного имплантата была обработана лазером. Патологический диагноз был подтвержден как оральный кандидоз. Пациент трижды подвергался лазерному лечению для лечения периодонтита. Через год его имплантаты (№42, №43, №44) были удалены из-за периодонтита в местной клинике. Согласно направлению от местной клиники, система имплантатов была внутреннего типа с фрикционным соединением, имела поверхность SLA, которая была установлена более 10 лет назад. Приблизительно через 3 года после лазерной операции на языковой стороне области #43 и #44 была обнаружена выпуклость. Была проведена инцизионная биопсия, и был поставлен диагноз SCC (рисунок). Были проведены дальнейшие исследования, включая лабораторные, рентгенографию грудной клетки, ЭКГ, МРТ, контрастную КТ, ПЭТ-КТ и сонографию шеи. Пациенту был поставлен диагноз стадия IVA cT4aN2cM0 в соответствии с системой TNM, предложенной Американским объединенным комитетом по раку (AJCC, 2018). Пациенту сразу назначили операцию, которая включала селективную диссекцию шеи, массивную резекцию с маргинальной мандибулектомией и реконструкцию с помощью радиального предплечья. Окончательный патологический отчет был хорошо дифференцированным плоскоклеточным раком, с размером опухоли 1,5 × 2,0 см, без метастазов в любой из 27 региональных лимфатических узлов и с четким хирургическим резекционным краем. Не наблюдалось сосудистых и периневральных инвазий; таким образом, пациенту был поставлен диагноз pT1N0M0, стадия I. В частности, опухолевые клетки сначала появились на поверхности мягких тканей слизистой оболочки, а затем проникли глубоко вдоль нитей имплантата. Пациенту не была назначена ни адъювантная радиотерапия, ни химиотерапия. Метастатический лимфатический узел был обнаружен на правом уровне IV ipsilateral на усиленном КТ, сделанном через 4 месяца после операции. Была проведена селективная диссекция шеи, включая правый уровень IV, и на правой верхней челюсти был обнаружен подозрительный для злокачественного поражения участок. Порезы на верхней челюсти пациента были подтверждены для SCC с помощью инцизионной биопсии; поэтому ему была проведена дополнительная операция через 13 дней после второй селективной диссекции шеи (рис. ). Окончательный патологический отчёт о поражении верхней челюсти был хорошо дифференцированным SCC с размером опухоли 2,0 × 1,4 см; глубина инвазии была 0,7 см. Было обнаружено вовлечение нижележащего костного участка. Порезы на хирургических резекциях были ясными. Хирургически удаленные образцы были зафиксированы в 10% нейтральном буферном формалине, обработаны в соответствии с обычным протоколом, а также были подготовлены серийные микроразрезы с различными антителами для иммуногистохимической окраски. Все файлы данных пациента были отобраны из файлов Департамента оральной и челюстно-лицевой хирургии, Стоматологической больницы Сеульского национального университета с одобрения институционального совета по обзору Сеульского национального университета (S-D20170026). Кровь пациента была собрана до операции, через 10 дней после операции и через 3 месяца после операции. После осаждения при комнатной температуре пробы были центрифугированы при 4000 об/мин в течение 20 минут. Были собраны только супернатанты и смешаны с лизоцимным буфером и использованы для IP-HPLC. Мы применили 100 мкг каждого белкового экстракта к процедуре иммунопреципитации с использованием белковой А/Г-агарозовой колонки (Amicogen Co., Корея). Белковые А/Г-агарозовые колонки были предварительно инкубированы отдельно с 1 мкг каждого из 20 различных антител, включая p53, muc1, muc4, TGF-β1, survivin, Wnt1, E-cadherin, β-катенин, матрикс-металлопротеиназу (MMP)-3, MMP-10, TNFα, HER1, HER2, PAI-1, NRAS, KRAS, CEA, Met, FASL и ERb. Коротко говоря, белковые пробы смешивались с 5 мл связывающего буфера (150 мМ NaCl, 10 мМ Tris pH 7.4, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 0.2 мМ натриевого vanadate, 0.2 мМ PMSF и 0.5% NP-40) и инкубировались в белковых А/Г-агарозовых колонках при 10°С в течение 1 часа. Колонки были помещены на вращающийся перемешиватель во время инкубации. После промывки каждой колонки достаточным количеством PBS-раствора (pH 7.3, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 43 мМ Na2HPO4-7H2O и 1.4 мМ KH2PO4) белок-мишень элюировали 150 мкл IgG-элюирующего буфера (Pierce Co., США). Иммунопреципитат белка анализировали с помощью HPLC (1100 series®, Agilent, США) с использованием колонки с обращенной фазой и микроаналитической системы детектора (SG Hightech Co., Корея), работающей с 0.15-М NaCl и 20% ацетонитрильным раствором при 0.4 мл/мин в течение 30 мин, и анализировали с помощью УФ-спектроскопии при 280 нм. В результатах IP-HPLC, пик белка-мишени, полученный в результате анализа HPLC в отрицательном контрольном образце, использовался для устранения пика антитела (mAU*s) [–]. Для сравнения сывороточного белка до операции и после операции пик белка-мишени был пропорционально нормирован по значению a-тубулина и отображен в виде полосы. Из опухолевой ткани были получены белковые экстракты, по 100 мкг каждого белкового экстракта для процедуры иммунопреципитации с использованием колонки белка А/Г агароза. Колонки белка А/Г агароза были предварительно инкубированы индивидуально с 1 мкг каждого из 9 различных антител, включая TNFα, NRAS, HER2, Met, E-кадгерин, р53, сурвивин, TGF-β1 и NFκB. Коротко, белковые пробы были смешаны с 5 мл буфера связывания (150 мМ NaCl, 10 мМ Tris pH 7.4, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 0.2 мМ натриевого vanadate, 0.2 мМ PMSF и 0.5% NP-40) и инкубированы в колонках белка А/Г агароза при 10°С в течение 1 часа. Для сравнения белковой области пика нормальной десны и ткани SCC, значения пика белка были пропорционально нормированы по значению α-тубулина и представлены в виде столбца. Были собраны обычные лабораторные результаты, включая полный анализ крови (КАК) с дифференциальным подсчетом, уровень С-реактивного белка (СРБ) и скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Незначительное повышение уровня СРБ в плазме в диапазоне, наблюдаемом у здоровых людей, является сильным прогностическим показателем будущих сосудистых событий []. Чен и др. [] сообщили, что наличие повышенного уровня СРБ в сыворотке крови до операции (> 5,0 мг/л) является независимым прогностическим показателем рака полости рта. Результаты анализов проб крови сравнивались с результатами первого визита, до операции, после операции и во время рецидива. Анализ IP-HPLC показал, что уровни p53, E-кадгерина, β-катенина, MMP-10, HER2, NRAS, Met и ERb снизились на 10-й день после операции. Уровни других белковых маркеров, связанных с онкогенной сигнализацией, повысились на 10-й день после операции. Это говорит о том, что онкогенные белки, такие как p53, E-кадгерин, β-катенин, MMP-10, HER2, NRAS, Met и ERb, высвободились из первичной опухоли; следовательно, уровни этих онкогенных белков снизились после опухолеабляционной операции (рис. ). Через 3 месяца после операции, используя сыворотку пациентки, все онкогенные белковые маркеры повысились, и возникло подозрение на рецидив опухоли или метастаз (рис. ). Анализ IP-HPLC показал, что NRAS, Met, p53 и NFкB были сверхэкспрессированы в ткани SCC при сравнении уровней онкогенных белков между нормальной десной и тканью SCC (рис. Воспалительные маркеры, такие как количество белых клеток крови (WBC), абсолютное количество нейтрофилов (ANC), СОЭ и CRP, были повышены сразу после операции. CRP не проводился до операции, поэтому эти данные нельзя сравнить с другими временными точками; однако уровни CRP не изменились значительно до и после второй операции (правая селективная диссекция шеи уровня IV, дополнительный файл: рисунок S1). Следует отметить, что количество СОЭ было повышено в предоперационный период, как было определено, когда злокачественное поражение было подтверждено инцизионной биопсией и сравнивалось с пробой, взятой при первом посещении. Это указывает на то, что некоторые воспалительные реакции могут влиять на потенциал злокачественной трансформации. Периоперационные изменения в эритроцитах, гемоглобине, гематокрите показали, что уровни снизились во время послеоперационного периода, но имели тенденцию к восстановлению с течением времени (Дополнительный файл: Рисунок S2). Доля сегментированных нейтрофилов увеличилась сразу после операции, что является характерной клеткой острых воспалительных реакций, поскольку они переместились в хирургическую рану сразу после травмы в течение нескольких минут. Кривые лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов показали противоположные тенденции от уровней сегментированных нейтрофилов (Дополнительный файл: Рисунок S3).