10-летняя сука йоркширского терьера весом 2,1 кг была доставлена в местную больницу с диспноэ. Наличие перикардиальной жидкости было подтверждено на УЗИ, которое затем было собрано под УЗИ-направлением, а физические и химические свойства перикардиальной жидкости были изучены для определения ее характеристик. Тесты на бактериальную и грибковую культуру дали отрицательные результаты, что указывает на отсутствие роста. Не было никаких отклонений в общем анализе крови и химических показателях сыворотки. Пациента направили в ветеринарный учебный госпиталь Канвонского национального университета. Из области, где он наблюдался под ультразвуковым контролем с местной анестезией, было собрано в общей сложности 30 мл перикардиальной жидкости; внутривенно было введено 1 мг/кг (0,2 мл) альфаксалона, после чего было введено еще 0,1 мл. Через 10–15 мин было введено 4 мл 2% лидокаина, разведенного в физиологическом растворе (1:1). Был смазан кровавый перикардиальный выпот и проведено цитологическое обследование. При цитологическом исследовании были обнаружены бинуклеация, анизоцитоз, анизокариоз, аномальные ядра (большие, угловатые и многоядерные), обильная базофильная цитоплазма, высокое соотношение ядерной и цитоплазматической частей (N:C) и грубая хроматина, а также крупные атипичные многоядерные клетки, что указывает на злокачественную опухоль высокой степени. Эти клетки можно обнаружить как индивидуально, так и в виде скоплений, объединенных с рядом эритроцитов. Рядом с этими клетками наблюдалось множество не дегенеративных нейтрофилов и макрофагов. Была обнаружена эритрофагия, что указывает на хроническое кровотечение (рисунки A-C). Выявление реактивных мезотелиальных клеток и мезотелиомы в перикардиальной жидкости является сложной задачей, особенно в присутствии воспаления, богатого нейтрофилами. Поэтому автор стремился выяснить, являются ли наблюдаемые клетки реактивными мезотелиальными, мезотелиальными или аденокарциномными клетками с помощью иммуноцитохимии с использованием пяти маркеров (цитокератин, виментин, десмин, Е-кадгерин и калиретинин) [, --]. Имуноцитохимия была проведена с помощью модификации метода, рекомендованного производителями антител; клетки мезотелиомы в качестве положительного контроля для каждого из первичных антител были подготовлены из хранящихся клеток мазка, которые были собраны у собаки, у которой после смерти был диагностирован мезотелиомы. В то время клетки мезотелиомы были размазаны и фиксированы в метаноле в течение 10 минут и хранились в стеклянной банке, содержащей 1x фосфатно-буферный раствор (PBS), при температуре 4 ℃ в течение нескольких месяцев. Для окрашивания каллеретинина и E-кадгерина мазки клеток из перикардиальных экссудатов фиксировали в метаноле при температуре -20 °C в течение 10 минут и трижды промывали PBS (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA) в течение 2 минут. Первичные антитела против каллеретинина (1:1000, Sigma C7479; хозяин: кролик; реактивность: человек, мышь, собака) и анти-E-кадгерин, Alexa Fluor 594 (10 мкг/мл, Biolegend 147,306; хозяин: крыса; проверенная реактивность: мышь, человек; сообщенная реактивность: макака, собака, свинья), разводили 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA)/PBS (Komabiotech, Сеул, Южная Корея). После ночной инкубации с первичными антителами при температуре 4 °C, мазки промывали трижды в PBS в течение 2 минут. Вторичное антитело Alexa Fluor 488 (10 мкг/мл, Invitrogen, A11034) козье анти-кроличье иммуноглобулин G (IgG; тяжелая + легкая цепь [H + L]) разводили 1% BSA/PBS. После ночной инкубации с вторичными антителами при температуре 4 °C, мазки промывали трижды в PBS в течение 2 минут. Мазки затем контрастировали с помощью монтажного средства, содержащего DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) и исследовали с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа LSM 780 (Carl Zeiss, Jena, Германия). Для окрашивания цитокератина и виментина использовались моноклональное антитело к пан-цитокератину (AE1/AE3), eFluor™ 570 (1 мкг/мл, Invitrogen 41-9003-82, Карлсбад, Калифорния, США), моноклональное антитело к виментину (V9) и флуоресцеин (1 мкг/мл, Invitrogen 11-9897-82); использовался тот же протокол (способ окрашивания или требуемое время), что и описанный выше, но с использованием другого вторичного антитела. Для окрашивания десмина использовалось моноклональное антитело десмина (D33) (1:100, Invitrogen MA5-13259) в качестве первичного антитела и анти-мышиное антитело козы IgG (H + L) Alexa Fluor 488 (1:500, Invitrogen A28175) в качестве вторичного антитела. Были выполнены те же процедуры, что и описанные выше. Имуноцитохимия перикардиальной жидкости была положительной для виментина (фиг. А) и цитокератина (фиг. В). DAPI (фиг. С) и объединенное изображение фиг. А-С представлены на фиг. D. Она также была положительной для десмина (фиг. Е). DAPI (фиг. F) и объединенное изображение фиг. Е, F представлены на фиг. G, H. Наконец, она была положительной для каллеретинина (фиг. А) и E-кадгерина (фиг. В). DAPI (фиг. С) и объединенное изображение фиг. А-С представлены на фиг. D. Поэтому был поставлен диагноз злокачественной мезотелиомы [,, –].