Pacienta este o fată, acum în vârstă de 11 ani, născută cu trei săptămâni mai devreme prin cezariană din cauza unei poziții transversale, cu o greutate la naștere de 2720 g. Nu au existat dificultăți de hrănire în copilărie sau mai târziu. Dezvoltarea motorie și a limbajului a fost întârziată: ea a început să meargă fără sprijin la vârsta de 2½ ani, iar la vârsta de 3 ani a spus primele cuvinte. La vârsta de 10 ani cunoștea alfabetul și a încercat să pună litere împreună. A folosit scutece până la vârsta de 8-9 ani. Modelul său de somn este ușor neregulat, cu treziri frecvente. Nu au fost detectate niciodată malformații congenitale sau epilepsie. Are o statură normală cu o lungime de-a lungul percentilei 25-50 și o greutate de-a lungul percentilei 25, dar circumferința capului a fost în intervalul normal inferior (2,5-5). Trăsăturile faciale sunt, de asemenea, normale - nu este clar dismorfică. Comportamentul este normal fără trăsături autiste, dar bruxismul este o problemă. Prefera compania copiilor mai mici. Nivelul său intelectual este considerat a fi comparabil cu ID-ul ușor-moderat, testarea formală a IQ-ului nu a fost încă efectuată. La vârsta de 9 ani, trio-ul de secvențiere a întregului exom (WES), comparând secvențele ADN-ului copilului cu cele ale părinților, a relevat o variantă de NAA10 de novo (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G, care a fost confirmată în continuare prin secvențiere Sanger. În conformitate cu alte variante de sens greșit NAA10, substituția V111G afectează un aminoacid foarte conservat. NAA10 este o proteină de 235 aminoacizi care adaptează pliul GNAT caracteristic comun subunităților catalitice NAT. Acest pliu constă în șase sau șapte lanțuri β și patru helici α. Lanțurile β 2-5 constituie nucleul proteinei. Aceste patru lanțuri β, împreună cu helixul α2 și bucla β6-β7 importantă pentru legarea substratului, sunt foarte conservate. V111 este localizat spre sfârșitul lanțului β5, iar o valină în această poziție este foarte conservată în omologul NAA10, precum și în alte câteva subunități catalitice NAT pentru care s-au rezolvat structurile cristaline, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) și 4LX9 (ssNAT)) [–]. Lanțul lateral al V111 formează un buzunar hidrofob împreună cu Y145, M147, L119 și L109. Este, de asemenea, în imediata apropiere (3.7 Å) a grupului sulfului Acetil-CoA (AcCoA), ceea ce ar putea indica un rol pentru V111 în poziționarea AcCoA. O glicină în această poziție nu va cauza niciun conflict steric, dar pierderea lanțului lateral hidrofob mai voluminos al valinei poate cauza modificări structurale care afectează stabilitatea proteinei sau legarea AcCoA. Pentru a evalua funcțional NAA10-V111G, am exprimat mai întâi His/MBP-NAA10-WT și His/MBP-NAA10-V111G în E. coli, am purificat enzimele și am testat activitatea NAT in vitro. Spre deosebire de His/MBP-NAA10-WT, a fost dificil să obținem o bună expresie proteică a moleculelor His/MBP-NAA10-V111G și o fracție substanțială a moleculelor purificate His/MBP-NAA10-V111G a fost eluată în volumul gol al coloanei de cromatografie de excludere prin mărime. Acest lucru indică faptul că părți ale agregatului proteic se află în unități mai mari de 200 kDa, cel mai probabil din cauza unei modificări a structurii proteinei sau a unei stabilități reduse a proteinei. Enzimele care au eluat la un volum al coloanei corespunzător monomerului His/MBP-NAA10-V111G au fost testate pentru activitatea catalitică și s-a demonstrat că au o activitate catalitică redusă cu aproximativ 85% comparativ cu His/MBP-NAA10-WT. Datorită nivelului redus de expresie și a producției de proteine a NAA10-V111G din transfecția E. coli și a purificării proteinelor, am transfectat celule HeLa cu plasmide care codifică NAA10-WT V5 sau NAA10-V111G V5, urmată de imunoprecipitare (IP) a proteinei supraexprimate cu ajutorul unui anticorp anti-V5. După aceea, activitatea NAT din precipitat a fost măsurată, iar cantitatea de NAA10 și NAA15 prezentă în fiecare probă a fost determinată prin SDS-PAGE și Western blot. Benzile din Western blot au fost cuantificate, iar activitatea catalitică măsurată a fost corelată cu cantitatea de NAA10-V5 prezentă în probă (adică un amestec de NAA10 monomeric și NAA10 complex cu NAA15 – complexul NatA), și separat corelată cu cantitatea de NAA15 prezentă în probă (adică cantitatea de complex NatA doar). Rezultatele experimentului IP-activity au fost în concordanță cu constatarea noastră anterioară: capacitatea de a acetilare a acidului N-terminus EEEI24 a fost redusă foarte mult de către NAA10-V111G. Totuși, a fost observată și o a doua caracteristică interesantă: După cum se poate observa din Western blot în Fig., mai multe NAA15 au fost co-imunoprecipitate cu NAA10-V111G-V5 comparativ cu NAA10-WT-V5. Acest lucru a fost reflectat și în măsurările activității NAT, unde proba de NAA10-V111G-V5 a arătat o formare mai mare a produsului NatA (pentru polipeptida SESS24 a substratului NatA) comparativ cu proba de NAA10-WT-V5, atunci când a fost corelată cu cantitatea totală de NAA10-V5 prezentă în probă. Totuși, atunci când a fost corelată cu cantitatea de NAA15 prezentă în fiecare probă, formarea produsului NatA per moleculă de NAA15 (și, prin urmare, complexul NatA) a fost aproximativ egală. Întrucât NAA10 monomeric are o activitate NAT de 1000 de ori mai mică față de complexul NatA comparativ cu NAA15, contribuția NAA10 monomeric la acetilarea SESS24 este minimă. Luate împreună, aceste date sugerează că NAA10-V111G a redus activitatea catalitică într-o formă monomerică, dar nu și în complex cu NAA15. Pentru a evalua rata de reînnoire a proteinelor NAA10-WT și NAA10-V111G, am exprimat moleculele NAA10-WT și NAA10-V111G etichetate cu V5 în celule HeLa și am efectuat experimente de urmărire a cicloheximidei. După cum se poate vedea în fig., molecula NAA10-V111G-V5 are o rată de reînnoire mai mare decât molecula NAA10-WT-V5. După 2 ore de tratament cu cicloheximidă, cantitatea medie de molecule NAA10-V111G-V5 a fost redusă cu aproximativ 80%, în timp ce moleculele NAA10-WT-V5 au fost reduse cu 20% în raport cu cantitatea de molecule NAA10 înainte de tratamentul cu cicloheximidă. Deși cantitatea de molecule NAA10-V111G-V5 a fost redusă drastic după 2 ore, nivelul de molecule NAA10-V111G-V5 pare să se stabilizeze în jurul valorii de 20%. Cel mai probabil, molecula NAA10-V111G-V5 supraexprimată este prezentă atât într-o formă monomerică instabilă, care este degradată rapid, cât și în complex cu NAA15, care stabilizează enzima și o protejează de degradare.