Un bărbat de 74 de ani s-a prezentat la medicul său generalist în august 2006, plângându-se de pierderi de memorie și a fost apoi trimis la neurolog. A prezentat un declin cognitiv global rapid asociat cu agresivitate, comportament bizar și pierderea limbajului. Acest lucru a fost însoțit de o anomie severă, dezinhibare și un scor de 10/30 pe MMSE. Nu au existat semne focale, mioclonie sau ataxie. Deteriorarea clinică a fost foarte rapidă și în decembrie 2006 a fost într-un sindrom asemănător cu akinetic-mutism cu postură anormală. Două scanări prin rezonanță magnetică (MRI) craniene, în octombrie și decembrie 2006, inclusiv secvențe T1, T2, FLAIR și DWI, au arătat semne moderate de atrofie cerebrală, dar nu și o creștere a semnalului anormal cortical sau al ganglionilor bazali. Electroencefalograma (EEG) nu a fost diagnosticată, iar nivelul proteinei 14-3-3 din lichidul cefalorahidian (CSF) a fost normal. Pacientul a murit în martie 2007. Istoricul familial al demenței a inclus un frate de 80 de ani diagnosticat cu probabilă boală Alzheimer. Nu s-au găsit mutații în cadrul de citire deschis după secvențierea genei proteinei prionice (PRNP). S-a observat o metionină valină (MV) heterozigoză în codonul 129. Modificări spongiforme moderate-moderate au fost prezente în neocortex, putamen/globus pallidus și talamus, leziunile fiind mai evidente în putamen și cortexul frontal. Vacuolele confluente nu au fost găsite în nicio regiune. Cu excepția câtorva vacuole focale în stratul molecular mai profund, cortexul cerebelos a fost altfel neobișnuit. Neuronii au fost în mare parte conservați în cortexul cerebral și ganglionii bazali, deși astroglioza focală a fost observată rar. Microglioza moderată-moderată a fost prezentă în cortexul cerebral și ganglionii bazali și în materia albă subcorticală, respectiv. Impunarea PrP fără pre-tratament cu proteinază K a arătat o colorare puternică caracterizată prin depuneri fine punctate (similare sinapselor) și depuneri granulare neregulate, adesea confluente, care puteau fi clasificate ca sinapse difuze. Depunerile perineuronale și cerebeloase asemănătoare plăcilor, plăcile kuru și plăcile floride au fost absente. După tratamentul cu PK, marea majoritate a colorării a dispărut, cu excepția câtorva depuneri granulare rezistente la PK PrP. Cerebelul a prezentat un model sinaptic discret asemănător în stratul molecular și granular, care a dispărut după tratamentul cu PK pre-tratament. Sensibilitatea la tratamentul cu PK pre-tratament a fost cel mai bine vizualizată în secțiuni consecutive cu și fără pre-tratament cu PK. Secțiunile paralele colorate cu anticorpul 3F4 au arătat o reducere marcată a imunoreactivității PrP, evaluată prin densitometrie, implicând 70-80% din totalul PrP în secțiunile de țesut. Acest lucru a fost confirmat în continuare prin incubarea secțiunilor de țesut cu anticorpul 1E4 și compararea modelului imunohistochimic PrP al unui caz sCJD MV1 cu probandul. După cum se arată în figură, imunoreactivitatea PrP sinaptică 3F4 și 1E4 în cazul comun MV1 a arătat imunoreactivitate rezistentă PrP. În contrast, imunoreactivitatea 3F4 și 1E4 a fost practic abolită după tratamentul cu PK pre-tratament în proband. Pe lângă aceste modificări, în cortexul entorhinal și perirhinal, în subiculum și în regiunile CA1 și CA3 ale hipocampului au fost prezente îngrămădiri de filamente și pre-îngrămădiri de filamente, precum și granule (boabe). Câteva pre-îngrămădiri și granule au fost observate și în amigdala. Aceste modificări au fost însoțite de câteva depuneri de tau hiper-fosforilat în neuronii girusului dentat, în corpurile încolăcite ale materiei albe a lobului temporal și în astrocite peri-ventriculare. În cortexul entorhinal și în amigdala au fost prezente câteva neuroni cu balonare imunoreactivi cu aB-cristalin. Patologia tau a fost în concordanță cu stadiul III al bolii Alzheimer și cu stadiul 3 al bolii granulelor argifile. Plăcile amiloide și incluziunile α-sinucleinei au fost absente. Nu s-au observat anomalii cu anticorpi anti-TDP-43. Procedura standard de Western blot pentru PrP (10% omogenat de creier și concentrație finală PK de 440 μg/ml) nu a reușit să detecteze PrPSc. Creșterea volumului încărcat în gel de la 5 la 10 μl a dat un semnal extrem de slab corespunzător a 24 și 19 kDa sub timpi de expunere a filmului saturați. Scăderea concentrațiilor PK (440, 100 și 50 μg/ml) a arătat o creștere a semnalului PrPSc, care a sugerat o proteină prionică sensibilă la PK. Chiar și atunci, doar două benzi de 24 și 19 kDa au fost vizibile. După creșterea procentului de omogenat de creier la 20%, același model cu două benzi a fost obținut. Folosind kitul TeSeE®, caracterizat prin condiții mai blânde de digestie PK, urmat de pași de purificare și concentrare a proteinei și colorare cu Sha31 Mab, a fost observată prezența a două benzi neașteptate de 21 și 16 kDa. Acest profil al benzii a fost observat în toate regiunile creierului și a constituit un rezultat izbitor, deoarece greutatea lor moleculară a fost diferită de cea detectată anterior cu Mab 3F4 și 6H4. Realizarea unei combinații de digestie, purificare și concentrare a eșantionului conform recomandărilor kitului TeSeE®, împreună cu detectarea utilizând 3F4 și 6H4, a dat un nou model. Nu numai că benzile anterioare de 24, 21, 19 și 16 kDa au fost prezente în fiecare eșantion, dar a fost observată și o bandă foarte slabă de 28 kDa și un fragment de aproximativ 6kDa în unele regiuni ale creierului. În plus, au fost obținute diferențe de intensitate a semnalului cu anticorpii 3F4 și 6H4, sugerând o afinitate diferită pentru PrPSc, care ar putea fi interpretată ca o conformație diferită a proteinei, în care epitopul de legare 3F4 a fost mai expus decât cel 6H4. Analiza deglicozilării a evidențiat trei izoforme aglicozilate de 19, 16 și 6 kDa, care au fost mai intense în cortex (parietal, frontal și temporal) și mai slabe în cortexul occipital și putamen/globus pallidus. În regiunea talamusului, au fost detectate două benzi, una mai intensă de 19 kDa și una mai slabă de 16 kDa. În cele din urmă, cerebelul a fost singura regiune în care a fost observată o singură bandă aglicozilată de 19 kDa, similară cu cea găsită în sCJD de tip 2. Cu toate acestea, nu putem exclude posibilitatea ca această constatare să fie rezultatul prezenței unei cantități mici de PrPSc și al unei subreprezentări a celorlalte benzi, așa cum s-a observat în talamus, unde o bandă de 16 kDa a fost observată doar în timpul expunerii mai lungi la film. Evaluarea sensibilității la digestia PK a fost realizată prin măsurarea absorbției PrPSc înainte și după tratamentul cu proteinază K, utilizând testul IDEXX HerdChek BSE. Această tehnologie se bazează pe captarea selectivă a PrPSc de către un polimer chimic specific, prin interacțiuni poliionice, în prezența PrPC dintr-o probă de omogenat de creier. Valorile absorbției scad cu diluțiile seriale, deci se poate presupune că cantitatea de PrPSc este direct proporțională cu absorbția. Scopul acestui protocol a fost de a efectua cuantificarea relativă a PrPSc fără tratament cu proteaze. Considerăm că introducerea unei etape de digestie ar putea fi utilă pentru a evalua cu ușurință rezistența relativă la digestia PK. Rezultatele au arătat că valorile absorbției au scăzut după tratamentul PK în toate probele (Tabelul). Pentru encefalopatia multi-infarct (MIE) și sCJD VV2, detectarea semnalului a fost redusă cu 4,32% și 2,02%, respectiv, dar reducerile nu au fost semnificative statistic. În schimb, probele de la proband și sCJD MM1 au arătat o reducere semnificativă statistică (p < 0,005) a semnalului cu 79,82% și 22,68%, respectiv. Valorile absorbției pentru MIE au fost sub pragul de semnificație, la același nivel cu controalele negative. Valorile rămase au fost peste pragul de semnificație. Aceste niveluri diferențiate de reducere a semnalului indică trei niveluri de rezistență la digestia PK: ridicat, intermediar și scăzut. O rezistență ridicată la digestia PK ar fi reprezentată de un procent redus de reducere a semnalului, așa cum s-a observat pentru sCJD VV2. În acest caz, reducerea de 2% a semnalului ar indica faptul că digestia PK ar degrada doar o fracție minimă de PrPSc, sugerând astfel o rezistență ridicată a proteinei prionice anormale. Rezistența intermediară ar fi reprezentată de un procent ușor mai ridicat de reducere a semnalului, așa cum s-a observat în cazul sCJD MM1, în care 22% ar indica o fracție degradabilă de PrPSc mai mare decât cea observată în cazul precedent. Aceasta ar reprezenta un tip de proteină doar ușor sensibilă la degradare cu proteaze, în funcție de regiunea creierului. Sunt în curs de desfășurare investigații suplimentare pentru a se elucida dacă acest nivel de degradare este asociat cu tipul de proteină MM1 sau cu un fenomen specific subiectului. În cele din urmă, rezistența scăzută la digestia PK ar fi reprezentată de un procent ridicat de reducere a semnalului, de exemplu 79% observat în proband, indicând faptul că o fracție mare de PrPSc este degradabilă. Acest lucru sugerează existența unor tipuri de proteine prionice anormale extrem de sensibile la digestia proteazei, care ar putea fi trecute cu vederea de metodele de detectare bazate pe rezistența caracteristică a proteinei prionice patologice la proteaze.