Un câine ciobănesc german de 11 ani, intact (GSD) a fost trimis la serviciul de urgență al Departamentului de Științe Clinice ale Animalelor de Companie al Facultății de Medicină Veterinară a Universității Utrecht cu un istoric de 2 zile de dispnee acută și slăbiciune generalizată. Vaccinarea și deparazitarea au fost efectuate în mod regulat. Câinele a vizitat Europa de Sud cu 6 luni înainte de prezentare. Nu s-au administrat medicamente înainte de dezvoltarea semnelor clinice și nu s-au raportat circumstanțe de mediu care ar putea provoca dispnee (de exemplu, expunerea la tutun, solvent organic, praf). Examenul fizic a arătat un câine receptiv, dar letargic, cu slăbiciune generalizată, dispnee severă, mucoase cianice, timp de refacere capilară prelungit, pulsuri periferice slabe, tahicardie (ritm cardiac 180 bătăi/min) și un murmur sistolic de gradul unu din șase, cu punctul de intensitate maximă deasupra apexului cardiac drept. La auscultarea pulmonară s-au auzit sunete pulmonare dure. Numărul total de celule sanguine (NBC) a arătat o leucocitoză matură ușoară (celule albe: 18,9 × 109/L; interval de referință 4,5–14,6 × 109/L) și un hemocrit de 56% (interval de referință 42–61%). Biochimia nu a arătat nicio anomalie. Analiza gazelor sanguine arteriale a arătat o hipoxemie severă (PaO2: 48,5 mm Hg; interval de referință 85–103 mm Hg) și o hipocapnie ușoară (PaCO2: 27,0 mm Hg; interval de referință: 32–43 mm Hg). Cauza suspectată pentru hipocapnie a fost hiperventilația. Concentrațiile de D-dimer și antithrombin au fost în intervalul de referință. Testul de antigen pentru dirofilaria immitis (SNAP® Heartworm RT Test, IDEXX Laboratories) și examenul fecal (tehnica de flotare și de izolare a larvelor prin Baermann) au fost negative. Radiografia toracică a arătat o dilatație a trunchiului arterei pulmonare și cardiomegalie dreaptă Ecocardiografia a fost foarte complicată din cauza anxietății severe și a respirației șuierătoare a câinelui și, prin urmare, a fost limitată. A prezentat o dilatație severă a ventriculului drept, o dilatație uniformă ușoară a arterei pulmonare principale, o aplatizare sistolică a septului interventricular și o regurgitare tricuspidă moderată. Aplicarea ecuației modificate a lui Bernoulli la viteza jetului de regurgitare tricuspidă a arătat o presiune arterială pulmonară sistolică estimată de 77 mm Hg, gradată ca PH severă (referință < 25 mm, PH sever > 75 mm Hg) ([]). Dimensiunile ventriculului stâng au fost semnificativ reduse, în concordanță cu volumul redus al părții stângi. A fost efectuată o ecocardiografie cu contrast salin, care a fost negativă, excluzând astfel șuntul intra- și extra-cardiac dreapta-stânga. Pentru a aborda hipoxemia severă și PH, câinele a fost plasat într-o cușcă cu oxigen cu o concentrație inspirată de oxigen între 40 și 50%. În plus, s-au administrat oral 1,5 mg/kg/8 ore sildenafil (Viagra®, Pfizer, New York, SUA) și 0,25 mg/kg/12 ore pimobendan (Vetmedin®, Boehringer Ingelheim, Germania). Această terapie nu a afectat semnificativ starea clinică a câinelui. Cu toate acestea, hipoxemia arterială s-a ameliorat ușor după prima zi de tratament (PaO2 a crescut de la 48,5 la 53 mm Hg, interval de referință 85–103 mm Hg). Ecocardiograma a fost repetată în a treia zi de tratament și schimbările ecocardiografice și severitatea PH au fost semnificativ reduse. Dilatația ventriculară dreaptă a scăzut dramatic, septul interventricular nu a mai fost aplatizat și gradientul de presiune al regurgitării tricuspide a fost redus de la 77 mm Hg la 41 mm Hg (interval de referință < 25 mm Hg). Prin urmare, terapia cu pimobendan și sildenafil a fost continuată în timpul perioadei de spitalizare (7 zile). Ca pași suplimentari de diagnostic, o scanare CT (pre- și post-contrast) cu apnee, urmată de o biopsie pulmonară chirurgicală în aceeași ședință de anestezie, au fost efectuate la 4 zile după prezentarea inițială. A fost folosit un scaner CT cu o singură fâșie helicoidală (Philips Secura, Philips NV, Eindhoven, Olanda). Setările tehnice au inclus fâșii helicoidale de 3 mm, 120 kV, 200 mA, 292 mm câmp vizual, 512 × 512 matrice și un algoritm de frecvență spațială mare. Pe imaginile CT, parenchimul pulmonar a arătat noduli de sticlă de fund centrilobulari subtili și o arteră pulmonară mărită. Liniile septale, efuzia pleurală și limfadenopatia au fost absente. Rezultatele CT au fost compatibile cu BP fără un diagnostic concludent. În urma scanării CT, a fost luată o biopsie pulmonară din lobul pulmonar cranial stâng (3 × 2 cm) pentru examinare histopatologică cu o mini-toracotomie. Imediat după această procedură a fost inițiată o terapie cu dexametazonă (0,25 mg/kg q24 h I.V., Rapidexon ®, Eurovet Animal Health, Bladel, Olanda) ca o ultimă soluție, în timp ce rezultatele histopatologice erau în așteptare (3 zile). Istopatologia biopsiei chirurgicale a plămânului a arătat o pneumonie histiocitară interstițială cronică moderată de etiologie necunoscută și atelectasis prin hematoxilină și eozină, acid periodic-Schiff și colorare Van Gieson. Modificările vasculare nu au fost inițial clar identificate. Din cauza răspunsului slab la tratamentul inițiat și a prognosticului slab suspectat pe baza rezultatelor histopatologice, câinele a fost eutanasiat. Autopsia a fost efectuată cu consimțământul informat al proprietarului. Patologia brută a plămânilor a arătat plămâni colapsați moderat cu un aspect marmorat difuz cu multiple focare roșii întunecate de 1 × 1 × 3 mm și un număr mic de focare albe de 1 × 1 × 1 mm, adesea înconjurate de o zonă roșie închisă (demarcare) distribuită aleatoriu în toate loburile pulmonare. Patologia de rutină a plămânilor a arătat remodelare vasculară multifocală. Pentru a diferenția arterele mici de vene, esențială pentru diagnosticarea PVOD, a fost adăugată o altă colorare care să vizualizeze fibrele elastice și colagenul (Weigert’s Resorcin Fuchsin) pentru a identifica lamina elastică. La câinele respectiv, ca și la persoanele cu PVOD, toate cele trei compartimente (artere, vene și capilare) ale microcirculației pulmonare au fost afectate, deși schimbările din sistemul venos pulmonar au fost cele mai pronunțate. Leziunile venulare au inclus proliferare intimală concentrică severă, obliterare parțială sau completă a lumenului și recanalizare post-trombotică. Leziunile capilare au fost organizate în focare, cel mai evident adiacent venulelor remodelate și au fost caracterizate prin proliferare de celule endoteliale cu capete plate (similare cu PCH). Congestia segmentară a capilarelor alveolare a fost, de asemenea, asociată în mod regulat cu focarele PCH. Leziunile arteriale au fost asemănătoare cu cele ale PAH cu îngroșare intimală concentrică prin creștere a matricei extracelulare și hipertrofie mediala, dar leziunile plexiforme complexe au fost absente. Aceste constatări au fost în concordanță cu constatările descrise de Williams et al. [] și, prin urmare, cu echivalentul uman al PVOD. ADN-ul genomic al cazului a fost izolat din sânge EDTA cu ajutorul unui robot de extracție semi-automatizat Chemagen (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH) și a fost stocat la − 20 °C. După aproximativ 6 ani, ADN-ul genomic al cazului și ADN-ul sănătos necorelat au fost analizate prin secvențiere a genomului întreg. Integritatea ADN-ului a fost verificată cu ajutorul unui bioanalizor (Agilent, Santa Clara, SUA) și cuantificată cu ajutorul unui Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, SUA). Bibliotele ADN au fost pregătite cu ajutorul kitului de pregătire a bibliotecilor TruSeq Nano (kitul de pregătire a bibliotecilor TruSeq Nano, Illumina, San Diego CA, SUA) folosind 200 ng ADN g ca intrare. Informațiile de secvențiere a genomului întreg la o acoperire de 30× au fost obținute cu ajutorul unui instrument HiSeqX Ten (instrumentul HiSeqX Ten, Illumina, San Diego CA, SUA) și 2 × 150 de perechi de baze de citiri de la capete. Datele au fost procesate cu ajutorul pipeline-ului nostru dezvoltat in-house v1.2.1 () care include analiza mutațiilor somatice (Strelka, VarScan, FreeBayes și MuTect) și un set de instrumente pentru analiza genomului (GATK v. 3.2.2) [] în conformitate cu cele mai bune practici []. Secvențele au fost mapate în raport cu genomul canin de referință (CanFam 3.1) utilizând alinierea Burrows-Wheeler cu potriviri exacte maxime (BWA-MEM) v0.7.5a [] urmată de duplicarea marcată, fuzionarea benzilor și realinierea indel-urilor. Recalibrarea bazei nu a fost efectuată. În medicina umană, mutațiile în BMPR2, ACVRL1, ENG, KCNK3, CAV-1 și SMAD9 au fost sugerate a fi cauzatoare pentru o formă autosomală dominantă de PAH [] Aceste gene au fost incluse în analize pentru a preveni lipsa de mutații candidate din cauza clasificării fenotipice greșite. Comparând cazul și controlul, analiza acestor gene a relevat 196 de variante intronice unice. Comparând secvența EIF2AK4 în caz și cea sănătoasă GSD a relevat 124 de variante unice, dintre care 9 au fost localizate în 3`-UTR, 112 au fost intronice și 3 au fost exonice. Cazul a fost mutant homozigot pentru c.2961T>C și c.1266G>A, o variație heterozigotă a fost găsită la c.2092G>A. Validarea variantei a fost efectuată prin secvențierea Sanger pe produsele amplificate ale reacției în lanț a polimerazei din ADN-ul genomic utilizând Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). După tratamentul cu exonuclease I, reacțiile de secvențiere ADN au fost efectuate utilizând BigDye v3.1 pe, secvențiate pe un ABI3130XL și analizate în Lasergene (versiunea 12.0 DNASTAR). Patru din cele cinci GSD-uri suplimentare, necunoscute pentru orice formă de stres respirator și cu vârsta de ≥ 10 ani au relevat genotip identic cu cazul și, prin urmare, au fost excluse ca variante cauzatoare pentru PVOD.