O femeie de 52 de ani cu antecedente de colecistectomie și rezecție parțială a lobului hepatic stâng în 2004 din cauza unui calcul biliar simptomatic și a mai multor leziuni biliare intrahepatice a prezentat febră intermitentă și icter progresiv de la începutul lunii noiembrie 2014. Obstrucția căilor biliare și o suspiciune de neoplasm hepatic hilar au fost detectate prin ultrasonografie, imagistică prin rezonanță magnetică (IRM), tomografie prin rezonanță magnetică și tomografie cu emisie de pozitroni (PET-CT) au fost aprobate de către Consiliul Instituțional de Revizuire de la Spitalul General al Armatei Populare Chineze. Niciun sponsor comercial nu a fost implicat în studii. Pacienții înscriși au dat consimțământul informat în scris, în conformitate cu Declarația de la Helsinki. Secvența ADN a fragmentului variabil de lanț unic (scFv) care vizează antigenul EGFR a fost derivată din JQ306330.1 (numărul GenBank). CAR-ul scFv-CD137-CD3zeta anti-EGFR a fost generat și clonat în structura vectorului lentiviral pWPT, descris în detaliu de către Feng et al. []. Construcția a fost verificată prin secvențierea ADN-ului. A fost produs un supernatant de vector lentiviral pseudotipizat, de grad clinic, prin transfecție tranzitorie standard, așa cum a fost descris de către McGinley et al. [] Conform instrucțiunilor producătorului pentru reacția de transfecție cu Lipofectamine 3000 (Invitrogen, SUA), plasmidul pWPT-anti-EGFR CAR, plasmidul de ambalare ps-PAX2 și plasmidul de înveliș pMD2.G au fost transfectați în celule 293 T. Supernatantele lentivirale au fost colectate și stocate la −80 °C. Vectorul GFP-CD137-CD3zeta a fost construit pentru a verifica eficiența transducției prin intermediul citometriei de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Secvența ADN a scFv care vizează antigenul CD133 a fost derivată din HW350341.1 (numărul GenBank), generarea, construcția și testarea celulelor CAR133 T au urmat aceeași procedură ca și celulele CART-EGFR (Fișier suplimentar: Figura S2). Celulele CART au fost fabricate din celule mononucleare din sânge periferic autolog (PBMC) colectate în tuburi de preparare a celulelor (BD Biosciences, San Jose, CA) purificate din 80 până la 100 ml de sânge total la Good Manufacturing Practice Facility a Spitalului General PLA din China, conform procedurilor standard de operare. PBMC au fost stimulate cu 50 ng/ml anti-CD3 MoAb (Takara, Japonia) și 500 U/ml interleucină-2 umană recombinantă (Peprotech, SUA) în mediu GT-T551 (Takara). Transducția lentivirală a fost efectuată în mediu GT-T551 cu sulfat de protamină (Sigma) timp de 24 de ore după 2 zile de cultură a celulelor T. După aceea, celulele au fost extinse în continuare în pungi de cultură (Takara) și recoltate ca celule CART. Bacteriile, ciupercile și endotoxina au fost testate înainte de perfuzia de celule CART. Immunofenotipul celulelor CART a fost analizat prin citometrie de flux cu anticorpi marcați fluorescent specific pentru colorarea CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L și CCR7. Au fost folosiți anticorpi monoclonali potriviți izotipic (BD Biosciences) pentru colorarea de control. Expresia CAR a fost estimată pe baza celulelor transduse cu GFP-CD137-CD3zeta din același lot pentru toți pacienții prin citometrie de flux. Achiziția și analiza datelor au fost realizate cu ajutorul unui citometru de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Citotoxicitatea in vitro a celulelor CART-EGFR a fost testată prin co-cultivare cu celule tumorale EGFR-pozitive în diferite rații efector-țintă în plăci cu 96 de godeuri folosind un kit de detectare CCK-8 de 4 ore (DOJINDO, Japonia). PCR cantitativă în timp real (Q-PCR) a fost utilizată pentru a evalua nivelul genei de fuziune CAR conform unui protocol descris anterior.13 Un fragment de 153 de perechi de bază (bp) care conține porțiuni ale lanțului CD8a și ale lanțului 4-1BB adiacent (primul 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ și primul 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) a fost amplificat de sistemul de detectare a secvenței ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Beta-actina a fost utilizată ca un control intern. A fost pregătită o curbă standard cu 7 puncte constând în 100 până la 108 copii/μl ADN plasmidic care conține gena CAR. Serumul IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF și Granzyme B au fost testate utilizând un imunotest sandwich cu microbead BD Biosciences, conform instrucțiunilor producătorului. Conform sistemului de cultură raportat anterior [], celulele CART-EGFR au fost generate din celulele mononucleare de 80-100 ml din sângele periferic al pacientului și eliberate pentru perfuzii. Din celulele perfuzate în timpul primului ciclu de terapie CART-EGFR, 99,14% au fost celule CD3+, compuse în principal din subsetul CD8+ (62,26%), iar 23,61% au fost caracterizate cu fenotip de memorie centrală (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). În plus, 8,99% din celulele perfuzate au fost pozitive pentru EGFR. Fenotipul și eficiența transfecției celulelor CART-EGFR perfuzate în fiecare ciclu sunt documentate în tabel. Celulele CART133 au fost generate și cultivate conform aceleiași proceduri ca și celulele CART-EGFR. Din celulele infuzate, 95,2% au fost celule CD3+, compuse în principal din subgrupul CD8+ (71,9%), iar 41,9% au fost celule CD45RO+/CD62L+/CCR7+. În plus, 6,4% din celulele infuzate au fost celule CD133 pozitive. Detaliile sunt documentate în tabel. Datorită radioterapiei finalizate recent în decurs de 2 luni și intoleranței la agenții chimioterapeutici, pacientului i s-au administrat 4 zile de perfuzii succesive de 2,2 × 106/kg de celule CART-EGFR în total, fără niciun tratament de condiționare, și a obținut un PR în prima evaluare 6 săptămâni mai târziu, evaluată conform Criteriilor de evaluare a răspunsului în cazul tumorilor solide versiunea 1.1 (RECIST 1.1) cu ambele scanări MRI și PET-CT, care a ilustrat o contracție de peste 80% a leziunilor metastatice în regiunea hilară hepatică și lobul caudatul și o scădere remarcabilă a SUV, împreună cu o scădere rapidă a CA199 de la 413,5 la 123,1 U/ml. Numărul de copii ale transgenului CAR în sângele periferic al pacientului a atins un maxim de 5916 pg/dl în ziua 9, însoțit de eliberarea de citokine, cum ar fi interleukina-6 (IL-6) și proteina C reactivă (CRP). Al doilea ciclu de monoterapie cu CART-EGFR a fost administrat cu o doză de celule T care exprimă EGFR-CAR+ de 2,1 × 106/kg și fără niciun tratament de condiționare prealabilă, deoarece numărul de copii ale transgenului CAR în sângele periferic a scăzut aproape de nivelul de referință la 2 luni după prima perfuzie cu celule T modificate genetic care exprimă CAR-EGFR. Examinările de rutină cu ajutorul scanărilor MRI și PET-CT au arătat un PR persistent, însoțit de o reducere suplimentară a CA199 la 61,2 U/ml. Interesant, numărul maxim de copii ale transgenului CAR după al doilea ciclu de perfuzie cu celule CART-EGFR nu a atins un nivel paralel sau mai mare decât cel atins în primul ciclu de CART-EGFR. Statutul PR al pacientei a fost menținut timp de 8,5 luni până când a dezvoltat vărsături frecvente, imposibil de controlat, durere abdominală, și reflux gastric, care au apărut la mijlocul lunii noiembrie 2015. Scanarea electronică ulterioară a stomacului a arătat strictura bulbului duodenal, iar scanarea PET-CT a confirmat progresia tumorii, ilustrând multiple noi leziuni anormale SUV în omentum majus, peritoneu și cavitatea abdominală. În consecință, pacientul a fost tratat cu 1 ciclu de terapie CART-EGFR combinată cu 2 cicluri de anticorp monoclonal anti-proteină 1 a decesului celular programat (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), care a fost administrat în doză de 100 mg la fiecare 2 săptămâni. În mod similar, numărul de copii transgenici CAR monitorizați în sângele periferic nu a atins un nivel similar de vârf al primei perfuzii a ciclului, chiar și în combinație cu anticorpul anti-PD-1. În ciuda faptului că CA199 seric a scăzut temporar de la 326,3 la 210,8 U/ml, următorul PET-CT a detectat apariția de noi metastaze în partea de jos a pelvisului, lobul drept al ficatului și ganglionul supraclavicular stâng, precum și extinderea leziunilor tumorale anterioare în abdomen, comparativ cu PET-CT înainte de imunoterapia combinată. Pentru că mai mult de 90% dintre celulele tumorale au exprimat proteina CD133 (fișă suplimentară: Figura S3), pacientul a fost apoi înscris în studiul CART133 și a primit perfuzia de 1,22 × 106/kg de celule CART specifice CD133 fără tratament de condiționare. Din cauza apariției obstrucției în duodenul descendent și a infecției persistente severe a căilor biliare, precum și a abcesului hepatic, care poate interfera cu nivelul CA199 seric și a fost tratat cu antibiotice, evaluarea imagistică programată a fost amânată până la 2 luni după perfuzia de celule CART133, în care CT cu contrast crescut a arătat o contracție remarcabilă sau chiar dispariția unor metastaze în peritoneu și în cavitatea abdominală, ceea ce a dus la o evaluare a PR și culturi de sânge, care nu au susținut diagnosticul de infecție, dar între timp escaladarea IL-6 și CRP și creșterea acută a glutamic-piroctic transaminazei și glutamic-oxalacetat transaminazei (>6ULN). Au apărut câteva erupții mici împrăștiate în coapsa stângă la 2 săptămâni după prima perfuzie de celule CART-EGFR, care s-au agravat treptat și au devenit evidente și pruritice cu apariția mai multor erupții cutanate solzoase sau liniare care s-au răspândit de la coapsa stângă la vițel și s-au unit, care a fost gradat 2 conform criteriilor comune de terminologie pentru evenimente adverse 4.0 (CTCAE 4.0), când s-a finalizat al doilea ciclu de imunoterapie CART. Erupțiile au fost biopsiate cu ilustrarea modificărilor patologice asemănătoare lichenului striat, cum ar fi pierderea epidermei parțiale, degenerarea vacuolară a celulelor bazale și infiltrarea a numeroase limfocite T în epidermă și apendicele acesteia, și au fost gestionate cu succes cu unguent tacrolimus. Nu a apărut hipotensiune arterială pe parcursul tratamentului CART-EGFR. Cu excepția greaței ușoare, a vărsăturilor, a frisoanelor, a febrei și a oboselii, nu au existat alte evenimente adverse acute în cursul tratamentului combinat. Deși a apărut mătreața și s-a agravat în urma imunoterapiei combinate, nu a fost nevoie de intervenții medicale. Nivelurile serice ale citokinelor, cum ar fi factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α), IL-6 și CRP, au crescut ușor și nu au indus niciun simptom de eliberare a citokinelor. În timpul perfuziei de celule CART133 în doze crescătoare succesive pe parcursul a 4 zile, nu au existat alte evenimente adverse, cu excepția febrei ușoare și a oboselii asociate cu perfuzia. Totuși, în a doua dimineață după finalizarea perfuziei de celule CART133, această pacientă a dezvoltat durere abdominală superioară intermitentă, frisoane, febră (39,1 °C), hemoragii punctiforme sporadice și erupții cutanate congestive pe gambele ei, care s-au răspândit rapid și difuz la nivelul gâtului, brațului superior drept, pieptului, abdomenului stâng și mucoasei retrofaringiene, însoțite de prurit și diaree în acea după-amiază și s-au agravat în următoarele 10 zile și ligandul proteinei de programare a morții 1 (PD-L1) [,], ducând la pierderea rapidă a capacității lor de a secreta citokine și de a-și exercita capacitatea de citotoxicitate și la intrarea într-o stare de hiposensibilitate []. În plus, tumorile solide demonstrează frecvent aberații metabolice prin consumul excesiv de aminoacizi esențiali pentru activitatea celulelor T și induc hipoxia și acidificarea extracelulară rezultată din insuficiența vasculară, care este ostilă supraviețuirii celulelor T [] Astfel, modularea micro-mediului tumoral este necesară pentru a îmbunătăți rezultatele. În acest caz, în ciuda faptului că pacientul nu a primit niciun tratament direct de condiționare cu scopul de a transforma micro-mediul tumoral, a fost tratat cu 60 Gy de radioterapie înainte de imunoterapie, cu un interval de aproximativ o lună de la sfârșitul radioterapiei până la începutul perfuziei cu celule CART. Deși radioterapia în sine nu a reușit să eradicheze efectiv celulele tumorale, efectul său direct și întârziat poate juca un rol în distrugerea stroma de susținere a tumorii, alterând biologia micro-mediului tumoral, promovând eliberarea mai multor antigene asociate tumorii și amplificând recunoașterea imună [] Mai mult, radioterapia poate face tumorile mai imunogene și mai susceptibile la un atac îmbunătățit de către celulele imune [], și chiar poate genera efecte antitumorale în acele metastaze îndepărtate care nu au fost iradiate local (denumit efect abscopal) [, ]. Prin urmare, avansăm o ipoteză conform căreia radioterapia poate fi o terapie condiționantă rezonabilă și eficientă pentru îmbunătățirea rezultatelor terapiei CART. Când rezistența la terapia CART-EGFR a fost confirmată, am încercat o dată o combinație de imunoterapie cu anticorp anti-PD-1 în asociere cu infuzia de celule CART-EGFR pe baza unui studiu preclinic care a demonstrat că blocarea imunosupresiei PD-1 ar putea spori semnificativ eficacitatea terapeutică a terapiei cu celule CART împotriva tumorilor solide stabilite [] Din păcate, acest tratament s-a încheiat cu un eșec, PET-CT-ul verificând progresia bolii, deși CA199 a fost redus temporar. O posibilă explicație este nivelul neclar al expresiei PD-L1. Recent, expresia PD-L1 este evidențiată pentru valoarea sa în prezicerea efectelor terapeutice ale medicamentelor anti-PD-1. Cu toate acestea, leziunea tumorală în acest caz a fost dificil de biopsie pentru localizarea sa anatomică, ceea ce a dus la faptul că nivelul expresiei proteinei PD-L1 pe celulele tumorale nu a putut fi detectat cu exactitate înainte de inițierea terapiei anti-PD-1, care există posibilitatea ca expresia PD-L1 în mediul tumoral să fie la nivel scăzut sau chiar negativă și, prin urmare, să conducă la eșecul tratamentului anti-PD-1. Între timp, au existat multe alte căi de control paralel care ar putea susține rezistența la terapia anti-PD-1 [] În această situație, selectarea unei ținte raționale a fost crucială pentru următoarea etapă a tratamentului pacienților. Recent, CSC-urile din CCA au atras atenția pentru proprietățile lor extrem de carcinogene și rolurile cheie în medierea auto-reînnoirii, reapariției tumorii și rezistenței terapeutice, prin urmare, terapia care a vizat markerii moleculari de suprafață și căile de semnalizare specifice CSC ar fi o opțiune potențială puternică pentru CCA [, ]. Printre moleculele utilizate individual sau în combinație pentru a identifica celulele stem ale colangiocarcinomului, CD133 este unul dintre cei mai importanți markeri ai celulelor stem care sunt asociați cu o invazivitate mai mare și cu un prognostic mai slab [] Shien și colegii au raportat, de asemenea, că celulele tumorale CD133-pozitive au arătat o rezistență mai mare la tratamentul post-operator decât celulele CD133 negative și că o creștere a expresiei CD133 a fost observată în celulele canceroase reziduale după terapia adjuvantă [] Pe baza celor de mai sus, am selectat în cele din urmă CD133 ca antigen țintă pentru imunoterapia CART, care, la rândul său, a produs un alt răspuns parțial și a demonstrat în continuare că imunoterapia CART cocktail poate fi fezabilă și rațională. O altă problemă importantă a fost toxicitatea, care ar putea fi indusă de celulele CART pe antigenele țintă exprimate pe celulele tumorale și/sau simultan pe țesuturile normale, denumită efect țintă off-tumor. Deteriorarea țesuturilor normale poate apărea chiar și din cauza reacției încrucișate neașteptate cu o proteină care nu este exprimată pe celulele tumorale []. De la inițierea perfuziei de celule CART-EGFR, această pacientă a prezentat nu numai febră, frisoane și oboseală asociate cu perfuzia, ci și febră susținută, creștere acută a transaminazelor serice și apariție întârziată a erupțiilor cutanate, însoțită de o creștere robustă a numărului de copii ale transgenului CAR, IL-6 și CRP, deși nivelurile acestora nu au îndeplinit criteriile de diagnosticare a sindromului de eliberare a citokinei [, ]. Citokinele masive care ar putea fi produse direct de celulele CART perfuzate au reflectat un răspuns imun puternic care ar putea genera atât efecte antitumorale asupra celulelor tumorale, cât și efecte secundare asupra țesuturilor normale. În plus, efectul țintă off-tumor cauzat de celulele CART-EGFR a fost probabil motivul declanșării toxicităților cutanate datorate distribuției EGFR pe epidermă []. Totuși, toate aceste evenimente adverse au fost ușoare, reversibile și au fost gestionate cu îngrijire de susținere și corticosteroid topic. Adăugarea anticorpului anti-PD-1 nu a agravat aparent toxicitățile imunoterapiei CART-EGFR în acest caz. Cu toate acestea, în tratamentul ulterior al perfuziei de celule CART133, această pacientă a suferit toxicități cutanate, orale, mucoase și gastrointestinale severe, cum ar fi erupții cutanate congestive și hemoragie. Deși aceste toxicități au fost gestionate cu succes prin intervenții medicale emergente, inclusiv metilprednisolon intravenos și inhibitori anti-TNF, mecanismul inerent poate fi datorat efectului țintă off-tumor al celulelor CART133 care au țintit antigenul CD133 exprimat pe epiteliul normal și pe vasele de sânge. În același timp, nu a fost clar dacă anticorpii anti-PD-1 și celulele CART-EGFR reziduale in vivo ar putea juca un rol în deteriorarea toxicităților imunoterapiei CART133.