Acest subiect a fost un bărbat de 22 de ani cu B-ALL care a avut o recidivă a măduvei osoase (BM) înainte de înscrierea în protocolul nostru clinic compasional folosind celule TanCAR-T 19/22. A fost diagnosticat cu B-ALL cu mai mult de 100 × 109/L WBC count și un cariotip normal în ianuarie 2016. După remisia completă (CR) 2, a suferit un haplo-HSCT de la tatăl său la 10 luni după diagnosticul original. A avut cistită hemoragică și GVHD acută gastrointestinală de gradul 1 în 2 luni după haplo-HSCT, care s-a rezolvat cu 15 doze zilnice de metilprednisolon 50 mg, urmate de 5 doze zilnice de metilprednisolon 100 mg. La 3 luni după întreruperea ciclosporinei A și a metilprednisolonului, boala sa a recidivat cu 6,4% blaste de măduvă osoasă când încă mai avea chimerism complet al donatorului, apoi a progresat rapid cu 56,5% blaste de măduvă osoasă prin citometrie de flux la 10,6 luni după haplo-HSCT și chimerism complet al donatorului a fost observat în același timp. A primit chimioterapie de salvare cu MOEP (3 doze zilnice de mitoxantron 10 mg, vindesină 4 mg, 3 doze zilnice de etoposid 100 mg și 5 doze zilnice de dexametazonă 15 mg) și a avut depresie severă a măduvei osoase și niciun răspuns cu 65,4% blaste de măduvă osoasă la 1 lună după primul ciclu de MOEP. Apoi, a fost tratat cu protocolul nostru de celule haplo-CAR-T 19. A primit chimioterapie de reducere a numărului de celule cu vindesină și metilprednisolon plus hidroxiuree și terapie de limfodepleție cu daunorubicină și ciclofosfamidă, iar blastele de măduvă osoasă au scăzut la 12,7% înainte de infuzia de celule haplo-CAR-T 19. Celulele haplo-CAR-T 19 la o doză de 4,91 × 106/kg (2,89 × 107 T cells/kg, 17% transfecție eficientă) au fost administrate și au indus MRD-CR (MRD-CR) și chimerism complet al donatorului în 2 săptămâni după infuzie. Celulele haplo-CAR-T 19 infuzate au prezentat o expansiune rapidă și au atins un vârf cu 15,281 copii per microgram ADN în primele 2 zile după infuzie, dar au scăzut de la 3374 copii per microgram ADN în ziua 7 la 468 copii per microgram ADN în ziua 12; metilprednisolon 160 mg și dexametazonă 5 mg au fost utilizate în ziua 11 pentru tratamentul sindromului de eliberare a citokinei de gradul 3 (CRS). A experimentat GVHD acut gastrointestinal în 1 lună după infuzia de celule haplo-CAR-T 19, care a fost sub control cu 5 doze zilnice de metilprednisolon 40 mg plus ciclosporină A 80 mg administrate din ziua 31 după infuzia de celule haplo-CAR-T 19. Cu toate acestea, la 1 lună după obținerea MRD-CR, boala sa a prezentat o floră progresivă cu un număr de WBC de 1,59 × 109/L și un procent corespunzător de blaste circulante de 1,39-67,37% în 2 săptămâni; măduva osoasă a prezentat o proliferare celulară foarte activă cu 59,67% blaste care au avut modelul de expresie CD19+ CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD58+ CD33- CD13- CD15-. În același timp, nu s-au observat celule haplo-CAR-T 19 și chimerism complet al donatorului. În acest caz, alte terapii, inclusiv TanCAR-T 19/22, mai degrabă decât chimioterapia de salvare sau reinfuzia de celule CAR-T 19, ar putea fi o opțiune de tratament potențială pentru acest pacient, din cauza răspunsului slab la chimioterapia de salvare și a persistenței slabe a celulelor CAR-T 19 infuzate. Cu toate acestea, încărcătura tumorală mai mare și intervalul scurt de timp după întreruperea tratamentului cu steroizi au crescut foarte mult riscul de eșec al generării de celule CAR-T autologe; progresia floridă a bolii a făcut ca așteptarea până când steroizii au scăzut să fie mai puțin fezabilă. Terapia cu celule TanCAR-T 19/22 derivate de la donatori a fost o abordare optimă pentru a depăși această problemă, dar, după cum se știe, terapiile cu celule haplo-CAR-T nu au fost recomandate în mod obișnuit în cazul unui GVHD anterior care a necesitat steroizi, în principal din cauza preocupărilor ridicate privind riscul ridicat de reactivare a GVHD. După o analiză mai atentă a beneficiilor clinice și a riscurilor celei de-a doua infuzii de celule haplo-CAR-T, acesta a fost înscris în protocolul nostru clinic compasional, folosind celule haplo-TanCAR-T 19/22. Tatăl său a fost supus aferezei, iar celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost folosite pentru a pregăti celulele TanCAR-T 19/22. A primit chimioterapie de citoreducție cu vindesină 4 mg și cinci doze zilnice de metilprednisolon 80 mg și trei doze zilnice de hidroxiuree 3 g, urmate de o chimioterapie de limfodepleție cu idarubicin, la o doză totală de 30 mg și ciclofosfamidă, la o doză totală de 3 g. Aspirația planificată a măduvei osoase după chimioterapia menționată mai sus și înainte de infuzia de celule haplo-TanCAR-T 19/22 nu a fost efectuată din cauza complianței scăzute a pacientului. Două zile mai târziu, a fost tratat cu celule haplo-TanCAR-T 19/22, la o doză totală de 4,72 × 106 celule TanCAR-T 19/22 pe kilogram (3,05 × 107 celule T pe kilogram, 15% eficacitate de transfecție), administrate prin dozare fracționată (D0, 30%; D1, 70%), din motive de siguranță. Materialele și metodele utilizate în producția TanCAR-T 19/22 au fost descrise anterior [–], cu excepția construcției CAR și a sursei de PBMC utilizate pentru fabricarea celulelor TanCAR-T 19/22. TanCAR-19/22 a fost o moleculă CAR în tandem, constând dintr-un scFv anti-CD22 derivat din mAb-ul m971 de șoarece [] și un scFv anti-CD19 derivat din mAb-ul FMC63 de șoarece [], unite în tandem, cu articulația CD8a umană și domeniul transmembranar, precum și cu domeniile de semnalizare CD137 și CD3z. Un schematic al TanCAR-19/22 este prezentat în Fig. a. PBMC-urile utilizate pentru fabricarea celulelor TanCAR-T 19/22 au fost colectate prin leucafereză, mai degrabă decât prin sânge periferic proaspăt (PB). Citometria de flux a fost utilizată pentru determinarea eficienței transfecției TanCAR-19/22 și cuantificarea celulelor haplo-TanCAR-T 19/22 în probele clinice utilizând un fragment specific de biotin-SP-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 (Jackson ImmunoResearch, SUA) și anticorpul PE Streptavidin (BD Biosciences, SUA). Celulele haplo-TanCAR-T 19/22 în probele clinice au fost, de asemenea, măsurate prin qPCR, conform descrierii []. Amploarea grefării donatorului în probele clinice a fost evaluată prin utilizarea amplificării repetărilor scurte în tandem și a PCR multiplex cu etichetare prin fluorescență, combinate cu electroforeza capilară, conform descrierii []. Nivelurile serului de interleucină (IL)-2, IL-6, IL-8 și IL-10 și factorul de necroză tumorală alfa au fost analizate în loturi, conform descrierii []. BM înainte de protocolul cu celule haplo-TanCAR-T 19/22 a arătat o predominanță a celulelor blastice cu absența precursorilor normali ai măduvei osoase. Citometria fluxului de la nivelul măduvei osoase în ziua 14 după perfuzia cu celule haplo-TanCAR-T 19/22 a indicat că existau 0,73% blasti reziduali. De remarcat, că blastii leucemici reziduali au prezentat modelul de expresie CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD33+ CD19− CD20−, care nu au fost detectați prin citometria fluxului în ziua 28 în absența unei terapii ulterioare. Având în vedere recuperarea incompletă a numărului de trombocite și neutrofile absolute până în ziua 28, acest pacient a obținut un MRD-CRi în ziua 28 după perfuzie. Nu a existat nicio dovadă de blasti în măduvă, fie prin frotiu de măduvă, fie prin citometrie de flux la seriile de timp ulterioare timp de 14 luni. Măduva osoasă a avut reconstituirea hematopoiezei normale până în ziua 56, cu excepția numărului de trombocite, care nu s-a recuperat încă la un nivel de 36 × 109/L la momentul raportului. Chimerismul total al donatorului a fost stabilit în ziua 14 după perfuzie și a rămas stabil ulterior. După perfuzie, celulele haplo-TanCAR-T 19/22 s-au înmulțit și au atins un nivel de 30,7% din celulele T circulante în ziua 12, urmat de o fază de contracție cu un nivel scăzut de 0,45% din celulele T circulante în ziua 28. Acest lucru a coincis cu eliminarea celulelor B circulante, care au fost aproape nedetectabile în ziua 28 prin citometrie de flux. Celulele haplo-TanCAR-T 19/22 au fost încă măsurabile cu un nivel scăzut de 2,29% din celulele T circulante, iar celulele B circulante nu și-au revenit încă la momentul raportului. Celulele haplo-TanCAR-T 19/22 au fost, de asemenea, prezente prin citometrie de flux la toate punctele de timp ale evaluării răspunsului în BM obținute la evaluarea răspunsului, iar aplasia cronică a celulelor B a fost documentată. S-a observat o concordanță generală între expansiunea și persistența celulelor haplo-TanCAR-T 19/22 în PB măsurate prin citometrie de flux și qPCR. În momentul raportului, ADN-ul TanCAR-19/22 a rămas detectabil pe qPCR cu 1134 și 396 de copii pe microgram ADN în PB și BM, respectiv. După infuzia de celule haplo-TanCAR-T 19/22, a prezentat CRS grad 3, gradat conform scalei de gradare UPenn [, ]. Febra de până la 38,8 °C a apărut în primele 24 de ore după infuzia de celule haplo-TanCAR-T 19/22, a durat 11 zile și a devenit afebrilă în ziua 12 după ce a fost tratată cu o doză mai mică de tocilizumab de 160 mg (1,6 mg/kg) și etanercept 50 mg în ziua 8. Mai multe citokine serice au crescut semnificativ în primele 7 zile după infuzie și aproape au revenit la valorile de bază în ziua 41, unde nivelurile de interleucină (IL)-6 au atins un nivel maxim de 3377 pg/mL (88 de ori peste nivelul de bază) în ziua 11. Aspartat aminotransferaza și lactat dehidrogenaza au crescut semnificativ în primele 8-10 zile după infuzie, au atins un nivel maxim de 1529,1 U/L (38 de ori peste limita superioară a valorilor normale) și 2027,8 U/L (13 de ori peste nivelul de bază) în ziua 12, și au revenit la valorile de bază în ziua 21 cu cel mai bun sprijin de îngrijire. A prezentat, de asemenea, disfuncție de coagulare cu timp de tromboplastină parțială activată prelungit, D-dimer crescut și concentrații scăzute de fibrinogen, precum și scurgeri capilare cu hipoalbuminemie de gradul 2, în ciuda suplimentării intensive cu proteine în timpul CRS, care s-a rezolvat în ziua 23. Stadiul 3 al GVHD cutanate acute, care era sub control, a fost reactivat și a progresat rapid spre stadiul 4 al GVHD cutanate, cu apariția de noi ulcerații cutanate locale, în special în pielea scrotului și în mucoasa bucală, la 11 zile după perfuzia cu celule haplo-TanCAR-T 19/22. Concentrația totală a bilirubinei serice a crescut continuu din ziua 12 și a atins 134 μmol/L în ziua 21. Având în vedere manifestările GVHD cutanate progresive rapid și implicarea ficatului, s-a administrat o doză mai mică de metilprednisolon, de 20 mg zilnic, ca doză inițială, cu scădere ulterioară, în efortul de a echilibra beneficiile și riscurile imunosupresiei sistemice, începând cu ziua 21 și până în ziua 39. Erupția cutanată și concentrația totală a bilirubinei serice s-au ameliorat semnificativ după aceste tratamente. Cu toate acestea, manifestările GVHD intestinale, în principal diareea, au apărut din ziua 50, iar concentrația totală a bilirubinei serice a crescut din nou, sugerând un GVHD acut de gradul 3. Șaisprezece doze de metilprednisolon 20 mg pe zi au fost administrate din nou din ziua 78, controlând semnificativ diareea și concentrația totală a bilirubinei serice. Acest pacient a prezentat ulterior GVHD cronică moderată, manifestată în principal sub formă de sclerodermie, diaree și scădere în greutate. Trombocitopenia persistentă cu număr de trombocite cuprins între 15 × 109 și 43 × 109/L, fără transfuzie de trombocite, a putut fi recunoscută ca o manifestare a GVHD cronice în contextul reconstituirii hematopoiezei normale. Tratamentul sistemic imunosupresiv a fost redus în decurs de 2 luni cu metilprednisolon 4 mg o dată la două zile și metotrexat 5 mg o dată pe săptămână și sirolimus 1 mg zilnic, ca doză minimă de întreținere, din ziua 154 până la momentul raportului, menținând GVHD cronică sub control bun.