O femeie de 47 de ani (greutate: 62 kg) a fost diagnosticată cu hepatită B cronică activă HBeAg-pozitivă în 1996. Parametrii virali, cum ar fi HBeAg, anti-HBe IgG și încărcătura virală plasmatică HBV din probe congelate au fost măsurate simultan de către un operator unic pentru a reduce variațiile intra și inter-test. HBeAg și anti-HBe au fost determinate prin electrochemiluminescență (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). Nivelurile încărcăturii virale HBV au fost determinate prin PCR în timp real (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, interval dinamic 30 IU/ml la 110,000,000 IU/ml) []. Inflamația ficatului a fost măsurată prin nivelurile serice ale alanin aminotransferazei (ALT). Pentru analiza secvenței, genele HBV pol și preC-core au fost secvențiate secvențial cu primer-uri, așa cum s-a descris anterior []. Analiza a fost efectuată cu ajutorul unui instrument ABI3100 (Applied Biosystems), iar secvențele introduse în această lucrare, precum și cele obținute din baza de date GenBank au fost aliniate cu ClustalX v1.83 [] și editate cu Bioedit v7.0.9.0 [] Genotipul HBV a fost evaluat prin inferență filogenetică, utilizând algoritmul Neighbor-joining cu modelul Kimura-two-parameter al evoluției moleculare din software-ul MEGA v3.1 [] Secvențe din ambele gene au fost obținute în diferite momente ale terapiei antivirale. O analiză mai detaliată a clonelor genului pol HBV a fost efectuată pe șapte izolate virale selectate din probe de ser recoltate în timpul terapiilor secvențiale. Fiecare produs PCR selectat al genului pol a fost clonat în vectorul pGEM-T Easy conform instrucțiunilor producătorului (Promega, Wisconsin, SUA) și cel puțin 15 clone au fost analizate suplimentar prin secvențiere. Acest lucru a permis analizarea evoluției cvasi-speciilor virale sub presiunile antivirale succesive pe baza analizei genului pol. Intervențiile de tratament anti-HBV însoțite de cinetica încărcăturii virale HBV și a nivelului ALT sunt descrise în figura. Terapia a fost inițiată când încărcătura virală HBV a crescut la 6,5 × 106 IU/ml. În 1998, când pacientul a fost tratat cu IFN-alfa 5 MU de trei ori pe săptămână timp de 30 de săptămâni, nivelul ADN HBV a fost mai mic decât limita de detecție. Această terapie a fost întreruptă și înlocuită în 1999 cu lamivudină (150 mg o dată pe zi). După 2 ani de tratament continuu, ADN HBV a fost detectabil (15,5 × 106 IU/ml). HBeAg a rămas negativ cu anti-HBe detectabil în timpul acestei perioade de tratament. În 2001, după o întrerupere de 6 luni, nivelul ADN HBV a evidențiat o reactivare post-tratament (1 × 108 IU/ml). La sfârșitul anului 2003, terapia cu lamivudină a fost reintrodusă (150 mg o dată pe zi). A fost însoțită de un eveniment rar de revenire la un profil HBeAg pozitiv/anti-HBe negativ, care a rămas detectabil timp de doi ani. Încărcătura virală a atins 3,1 × 106 IU/ml în acest moment. Zece luni mai târziu, în 2006, regimul de lamivudină a fost înlocuit cu monoterapia cu adefovir (10 mg/zi). Inițial, nivelurile încărcăturii virale au fost scăzute (8,5 × 104 IU/ml), dar după 48 săptămâni de terapie, aceste niveluri au atins 7,15 × 106 IU/ml. Nivelurile ALT au fost normale în acest interval. Reactivarea replicării HBV a fost presupusă având în vedere detectarea simultană a HBeAg/anti-HBe [] și replicarea ridicată detectată. Concurența HBeAg și anti-HBe nu pare a fi neobișnuită în rândul pacienților care nu au primit niciodată tratament antiviral, dar prevalența sa la pacienții cu experiență în terapie nu este cunoscută. Acest model serologic a fost legat de leziuni hepatocitare extinse și leziuni hepatice mediate imun severe și disfuncție consecutivă []. Șase luni mai târziu, nivelul ALT a crescut ușor (1,5 × limita superioară normală - UNL -) și a fost instituită monoterapia cu entecavir (1 mg zilnic). După o monoterapie cu entecavir de 5 luni, tenofovir (300 mg o dată pe zi) a fost adăugat la regimul de tratament pentru terapie dublă. ADN-ul HBV a scăzut la 1 × 105 IU/ml timp de patru luni, dar trei luni mai târziu încărcătura virală a atins > 1.1 × 108 IU/ml. În plus, o creștere a nivelului ALT (20 × UNL) a denotat inflamație hepatică. În timpul următoarelor 48 de săptămâni, replicarea virală a scăzut ușor la 6.1 × 106 IU/ml dar a revenit mai întâi la 3.6 × 107 IU/ml și mai târziu la > 1.1 × 108 IU/ml. Mai recent (a doua jumătate a anului 2010), nivelurile ADN-ului HBV au fluctuat între 4.3 × 104 IU/ml și 4.9 × 107 IU/ml. Până la sfârșitul perioadei de urmărire a studiului, am reușit să măsurăm concentrația tenofovirului în plasmă prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în trei probe consecutive, la 20 de ore după administrare, atingând 71.6 ng/ml ± 47.6 (media ± SD). Nivelurile ALT-AST au rămas ușor crescute (2 × UNL) în timpul ultimilor doi ani de urmărire. Isolații HBV de la pacient au fost atribuite genotipului A2 pe baza asemănării filogenetice dintre secvențele genomice parțiale HBV din genele pol și preC-C. O altă analiză genotipică longitudinală, inclusiv compoziția cvasi-speciilor de tulpini HBV izolate de la pacient, a relevat prezența mutațiilor de rezistență pe baza secvențelor genice pol (Tabelul). La începutul tratamentului cu lamivudină, HBV a fost de tip sălbatic în toate clonele. După 2 ani de astfel de terapie, această populație virală a fost complet înlocuită de mutația rtM204I - care a prezentat în mod omogen rezistență la lamivudină. Când această terapie a fost întreruptă timp de 6 luni, compoziția cvasi-speciilor a constat aproape exclusiv din secvențe de nucleotide pol de tip sălbatic, cu excepția unei contribuții minore (< 10%) care a prezentat mutația I233V asociată cu rezistența la adefovir. Odată ce terapia cu lamivudină a fost reintrodusă și până când au fost administrate entecavir plus tenofovir, au fost detectate în mod invariabil mutațiile duble asociate cu rezistența la lamivudină rtL180M și rtM204I. În cadrul ultimului regim terapeutic, au fost detectate doar mutațiile A181T și T184L asociate cu rezistența la lamivudină și adefovir și entecavir, respectiv. În plus, alte două variații au fost detectate în domeniul catalitic al reverstranscriptazei în momentul rezistenței la lamivudină. Aceste variante rtA200V și rtI253V au rămas prezente în timpul tratamentului cu entecavir și au fost, de asemenea, detectate în probele secvențiate după apariția rezistenței în timpul tratamentului cu entecavir. Caracterizarea genomică a HBV la nivelul preC-C a arătat prezența unei duble mutații A1762T și G1764A, care a fost detectată timpuriu când pacientul nu a fost tratat, rămânând în această condiție pe parcursul întregii perioade de urmărire. Mutația T1753C a fost, de asemenea, detectată în mod constant. Prezența acestor mutații ale promotorului de bază este, de asemenea, legată de profilul concurent HBeAg-antiHBe menționat mai sus, găsit la acest pacient, așa cum s-a raportat recent [].