A paciente é uma menina, agora com 11 anos, nascida três semanas antes do tempo por cesariana devido a uma posição transversal, com um peso ao nascer de 2720 g. Não houve dificuldades de alimentação na infância ou mais tarde. O desenvolvimento motor e da linguagem foi atrasado: ela andou sem apoio aos 2 anos e meio de idade, e aos 3 anos disse as suas primeiras palavras. Aos 10 anos conhecia o alfabeto e tentou juntar as letras. Usou fraldas até aos 8-9 anos. O seu padrão de sono é ligeiramente irregular com despertares frequentes. Nunca foram detetadas malformações congénitas ou epilepsia. Tem estatura normal com comprimento ao longo do percentil 25-50 e peso ao longo do percentil 25, mas a sua circunferência da cabeça esteve no intervalo normal inferior (2.5º - 5º percentil). As suas características faciais são também normais - não é claramente dismórfica. O comportamento é normal sem traços autistas, mas o bruxismo é um problema. Prefere a companhia de crianças mais novas. O seu nível intelectual é considerado comparável a um ID ligeiro-moderado, ainda não foram feitos testes de QI formais. Aos 9 anos, a sequenciação do exoma completo (WES), comparando a sequência de ADN da criança com a dos progenitores, revelou uma variante de NAA10 de novo (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G, que foi ainda mais confirmada pela sequenciação de Sanger. Em linha com outras variantes missense NAA10, a substituição V111G afeta um aminoácido altamente conservado. NAA10 é uma proteína de 235 aminoácidos que adapta a característica dobragem GNAT comum às subunidades catalíticas NAT. Esta dobragem consiste em seis ou sete cadeias β e quatro hélices α. As cadeias β 2-5 constituem o núcleo da proteína. Estas quatro cadeias β, juntamente com a hélice α2 e o loop β6-β7 importante para a ligação do substrato, são altamente conservadas. V111 está localizada no final da cadeia β5, e uma valina nesta posição é altamente conservada em homólogos NAA10, bem como em várias outras subunidades catalíticas NAT para as quais foram resolvidas estruturas cristalinas, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) e 4LX9 (ssNAT)) [–]. A cadeia lateral de V111 está a formar um bolso hidrofóbico juntamente com Y145, M147, L119 e L109. Está também muito perto (3.7 Å) do grupo de enxofre do Acetil-CoA (AcCoA), o que pode indicar um papel para V111 no posicionamento do AcCoA. Uma glicina nesta posição não causará quaisquer conflitos estéricos, mas a perda da cadeia lateral hidrofóbica mais volumosa da valina pode possivelmente causar alterações estruturais que afetem a estabilidade da proteína ou a ligação do AcCoA. Para avaliar funcionalmente o NAA10-V111G, primeiro expressamos o His/MBP-NAA10-WT e o His/MBP-NAA10-V111G em E. coli, purificamos as enzimas e testamos a atividade NAT in vitro. Ao contrário do His/MBP-NAA10-WT, foi difícil obter uma boa expressão da proteína do His/MBP-NAA10-V111G, e uma fração substancial das moléculas purificadas de His/MBP-NAA10-V111G eluíram no volume vazio da coluna de cromatografia de exclusão por tamanho. Isto indica que partes da proteína agregam-se em unidades maiores que 200 kDa, muito provavelmente devido a uma alteração da estrutura da proteína, ou a uma estabilidade reduzida da proteína. As enzimas que eluíram num volume de coluna correspondente ao monomérico His/MBP-NAA10-V111G foram testadas quanto à atividade catalítica e mostraram ter uma redução de aproximadamente 85% na atividade catalítica comparada ao His/MBP-NAA10-WT. Devido aos baixos níveis de expressão e rendimento de proteína de NAA10-V111G a partir da transfecção de E. coli e purificação de proteínas, transfectamos células HeLa com plasmídeos que codificam para NAA10-WT V5 ou NAA10-V111G V5, seguido por imunoprecipitação (IP) da proteína sobre-expressa com um anticorpo anti-V5. A atividade NAT no precipitado foi então medida, e a quantidade de NAA10 e NAA15 presentes em cada amostra foi determinada por SDS-PAGE e Western blot. As bandas do Western blot foram quantificadas, e a atividade catalítica medida foi correlacionada com a quantidade de NAA10-V5 presente na amostra (i.e. uma mistura de NAA10 monomérica e NAA10 em complexo com NAA15 - o complexo NatA), e correlacionada separadamente com a quantidade de NAA15 presente na amostra (i.e. a quantidade do complexo NatA apenas). Os resultados do experimento de atividade IP corresponderam bem com nossa descoberta anterior: a habilidade de NAA10-V111G de acetilar o N-terminal ácido EEEI24 foi bastante reduzida. No entanto, também revelou uma segunda característica interessante: como pode ser visto no Western blot na Fig., mais NAA15 co-imunoprecipitou com NAA10-V111G-V5 em comparação com NAA10-WT-V5. Isso também foi refletido em nossas medidas de atividade NAT onde a amostra de NAA10-V111G-V5 imunoprecipitada mostrou maior formação de produto NatA (para o polipeptídeo substrato NatA SESS24) em comparação com a amostra de NAA10-WT-V5 imunoprecipitada quando correlacionada com a quantidade total de NAA10-V5 presente na amostra. No entanto, quando correlacionada com a quantidade de NAA15 presente em cada amostra, a formação de produto NatA por NAA15 (e, portanto, o complexo NatA) foi aproximadamente igual. Como o monomérico NAA10 tem uma atividade NAT 1000 vezes menor em relação aos substratos NatA comparados com o complexo NatA [], a contribuição do monomérico NAA10 na acetilação de SESS24 é mínima. Juntos, isso sugere que o NAA10-V111G tem uma atividade catalítica reduzida na forma monomérica, mas não no complexo com NAA15. Para avaliar a renovação de proteínas de NAA10-WT e NAA10-V111G, expressamos NAA10-WT e NAA10-V111G com a tag V5 em células HeLa e realizamos experimentos de cicloeximida. Como pode ser visto na Fig., a NAA10-V111G-V5 tem uma taxa de renovação maior que a NAA10-WT-V5. 2 h após o tratamento com cicloeximida, a quantidade média de NAA10-V111G-V5 foi reduzida em aproximadamente 80%, enquanto as moléculas de NAA10-WT-V5 foram reduzidas em 20% em relação à quantidade de moléculas de NAA10 antes do tratamento com cicloeximida. Embora a quantidade de NAA10-V111G-V5 tenha diminuído drasticamente após 2 h, o nível de NAA10-V111G-V5 parece se estabilizar em torno de 20%. Muito provavelmente, a sobreexpressão de NAA10-V111G-V5 está presente tanto em uma forma monomérica instável que é degradada rapidamente e em complexo com NAA15, que estabiliza a enzima e a protege da degradação.