Um homem de 74 anos apresentou-se ao seu médico de família em agosto de 2006, queixando-se de perda de memória e foi então encaminhado para o neurologista. Ele apresentou um rápido declínio cognitivo global associado a agressividade, comportamento bizarro e perda de linguagem. Isto foi acompanhado por uma anomia grave, desinibição e uma pontuação de 10/30 no MMSE. Não houve sinais focais, mioclonia ou ataxia. A deterioração clínica foi muito rápida e em Dezembro de 2006 ele estava num síndrome semelhante a um mutismo acinético com postura anormal. Duas ressonâncias magnéticas (MRI) cranianas, em Outubro e Dezembro de 2006, incluindo sequências T1, T2, FLAIR e DWI, mostraram sinais moderados de atrofia cerebral mas sem aumento do sinal anormal cortical ou dos gânglios basais. O eletroencefalograma (EEG) não foi diagnóstico e o nível da proteína 14-3-3 no fluido cerebrospinal (CSF) foi normal. O paciente morreu em Março de 2007. A história familiar de demência incluiu um irmão de 80 anos diagnosticado com doença de Alzheimer provável. Não foram encontradas mutações no quadro de leitura aberta após o sequenciamento do gene da proteína prião (PRNP). Observou-se uma metionina valina heterozigótica (MV) no codão 129. A mudança espongiforme moderada a leve estava presente no neocórtex, no putamen/globus pallidus e no tálamo, com as lesões sendo mais evidentes no putamen e no córtex frontal. Não foram encontradas vaculações confluentes em nenhuma região. Exceto por algumas vaculações focais na camada molecular mais profunda, o córtex cerebelar era, de outra forma, insignificante. Os neurônios foram, em grande parte, preservados no córtex cerebral e nos gânglios basais, embora a astrogliose focal fosse raramente observada. A microgliose moderada a leve estava presente no córtex cerebral e nos gânglios basais, e na substância branca subcortical, respectivamente. A imunocoloração de PrP sem pré-tratamento com proteinase K mostrou uma forte coloração caracterizada por finos depósitos pontuados (semelhantes a sinapses) e depósitos granulares irregulares, frequentemente confluentes, que poderiam ser categorizados como sinapses difusas. Os depósitos perineurais e cerebelares semelhantes a placas, as placas de kuru e as placas floridas estavam ausentes. Após o pré-tratamento com PK, a vasta maioria da coloração desapareceu, exceto alguns depósitos granulares de PrP resistentes a PK. O cerebelo mostrava um padrão sináptico discreto semelhante ao das camadas molecular e granular, que desapareceu após o pré-tratamento com PK. A sensibilidade ao pré-tratamento com PK foi melhor visualizada em seções consecutivas com e sem pré-tratamento com PK. As seções paralelas coradas com o anticorpo 3F4 mostraram uma redução acentuada da imunorreatividade de PrP, conforme avaliado por densitometria, envolvendo 70-80% do total de PrP nas seções de tecido. Isto foi ainda mais confirmado pela incubação de seções de tecido com o anticorpo 1E4 e pela comparação do padrão imunohistoquímico de PrP de um caso de sCJD MV1 com o do probando. Como mostrado na Figura, a imunorreatividade sináptica de PrP 3F4 e 1E4 no caso comum MV1 mostrou imunorreatividade de PrP resistente. Em contraste, a imunorreatividade de 3F4 e 1E4 foi praticamente abolida após o pré-tratamento com PK no probando. Além dessas alterações, emaranhados neurofibrilares e pré-emaranhados, bem como grãos, estavam presentes no córtex entorinal e perirrinal, no subículo e nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo. Alguns pré-emaranhados e grãos também foram observados na amígdala. Essas alterações foram acompanhadas por alguns depósitos de tau hiperfosforilados em neurônios do giro dentado, corpos espirais na substância branca do lobo temporal e astrócitos peri-ventriculares. Neurônios emaranhados, imunorreativos a aB-cristalina, estavam presentes no córtex entorinal e na amígdala. A patologia tau foi consistente com o estágio III da doença de Alzheimer e com o estágio 3 da doença de grãos argirófilos. Placas amilóides e inclusões de a-sinucleína estavam ausentes. Não foram encontradas anormalidades com anticorpos anti-TDP-43. O procedimento padrão de Western-blot de PrP (10% de homogeneizado de cérebro e concentração final de PK de 440 μg/ml) não conseguiu detectar PrPSc. Aumentar o volume carregado no gel de 5 para 10 μl produziu um sinal extremamente fraco correspondente a 24 e 19 kDa sob tempos de exposição de filme de saturação. A diminuição das concentrações de PK (440, 100 e 50 μg/ml) mostrou um aumento no sinal de PrPSc, o que sugeriu uma proteína prião PK-sensível. Mesmo assim, apenas duas bandas de 24 e 19 kDa foram visíveis. Depois de aumentar a percentagem de homogeneizado de cérebro para 20%, o mesmo padrão de duas bandas foi obtido. Usando o kit TeSeE®, caracterizado por condições de digestão PK mais suaves, seguidas por etapas de purificação e concentração da proteína e coloração com Sha31 Mab, a presença de duas bandas inesperadas de 21 e 16 kDa foi revelada. Este perfil de banda foi observado em todas as regiões do cérebro e constituiu um resultado impressionante, uma vez que o seu peso molecular era diferente do que o anteriormente detectado com Mab 3F4 e 6H4. A realização de uma combinação de digestão, purificação e concentração da amostra de acordo com as recomendações do kit TeSeE®, juntamente com a deteção utilizando 3F4 e 6H4, produziu um novo padrão. Não só as bandas anteriores de 24, 21, 19 e 16 kDa estavam presentes em cada uma das amostras, mas também uma banda muito fraca de 28 kDa e um fragmento de aproximadamente 6kDa foram observados em algumas regiões do cérebro. Além disso, foram obtidas diferenças de intensidade de sinal com os anticorpos 3F4 e 6H4, sugerindo afinidade diferencial para PrPSc, que poderia ser interpretada como uma conformação proteica diferente, na qual o epítopo de ligação 3F4 estava mais exposto do que o 6H4. A análise de desglicosilação revelou três isoformas aglicosiladas de 19, 16 e 6 kDa, que foram mais intensas no córtex (parietal, frontal e temporal) e mais fracas no córtex occipital e no putamen/globus pallidus. Na região do tálamo, foram detetadas duas bandas, uma mais intensa de 19 kDa e uma mais fraca de 16 kDa. Por último, o cerebelo foi a única região onde foi observada uma única banda aglicosilada de 19 kDa, semelhante à encontrada na ECJ tipo 2. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que esta descoberta tenha sido o resultado da presença de uma pequena quantidade de PrPSc e de uma sub-representação das outras bandas, como observado no tálamo, onde uma banda de tamanho de 16 kDa foi observada apenas com tempos de exposição de filme mais longos. A avaliação da sensibilidade à digestão PK foi realizada através da medição da absorvância de PrPSc antes e depois do tratamento com proteinase K, utilizando o teste IDEXX HerdChek BSE. Esta tecnologia baseia-se na captura seletiva de PrPSc por um polímero químico específico, através de interações poli-iónicas, na presença de PrPC de uma amostra de homogeneizado de cérebro. Os valores de absorvância diminuem com diluições em série, pelo que se pode assumir que a quantidade de PrPSc é diretamente proporcional à absorvância. O objetivo deste protocolo foi realizar a quantificação relativa de PrPSc sem tratamento com proteases. Consideramos que a introdução de uma etapa de digestão pode ser útil para avaliar facilmente a resistência relativa à digestão PK. Os resultados mostraram que os valores de absorvância diminuíram após o tratamento PK em todas as amostras (Tabela). Para a encefalopatia multi-infarto (MIE) e sCJD VV2, a deteção do sinal foi reduzida em 4,32% e 2,02%, respetivamente, mas as reduções não foram estatisticamente significativas. Em contraste, as amostras do probando e sCJD MM1 mostraram uma redução estatisticamente significativa (p < 0,005) do sinal em 79,82% e 22,68%, respetivamente. Os valores de absorvância para MIE foram abaixo do limite, ao mesmo nível que os controlos negativos. Os restantes valores foram acima do limite. Estes níveis diferenciados de redução de sinal são indicativos de três níveis de resistência à digestão PK: alto, intermédio e baixo. Um alto nível de resistência à digestão PK seria representado por um baixo percentual de redução de sinal, como observado para sCJD VV2. Neste caso, a redução de 2% no sinal indicaria que a digestão PK degradaria apenas uma fração mínima de PrPSc, sugerindo, assim, uma alta resistência da proteína prião anormal. A resistência intermédia seria representada por um percentual ligeiramente superior de redução de sinal, como observado em sCJD MM1, em que 22% apontaria para uma fração degradável de PrPSc superior à observada no caso anterior. Isto representaria um tipo de proteína apenas ligeiramente sensível à degradação com proteases, dependendo da região do cérebro. Estão a ser realizadas mais investigações, a fim de elucidar se este nível de degradação está associado ao tipo de proteína MM1 ou a um fenómeno específico para este assunto. Finalmente, a baixa resistência à digestão PK seria representada por um alto percentual de redução de sinal, por exemplo, os 79% observados no probando, indicando que uma fração elevada de PrPSc é degradável. Isto sugere a existência de tipos de proteínas prião anormais extremamente suscetíveis à digestão de proteases, que podem potencialmente ser ignorados por métodos de deteção baseados na característica resistência à proteinase da proteína prião patológica.