Um cão pastor alemão de 11 anos de idade, intacto (GSD) foi encaminhado ao serviço de emergência do Departamento de Ciências Clínicas de Animais de Companhia da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Utrecht com uma história de 2 dias de dispneia aguda e fraqueza generalizada. A vacinação e desparasitação foram realizadas regularmente. O cão visitou o sul da Europa 6 meses antes da apresentação. Não foram administrados medicamentos antes do desenvolvimento dos sinais clínicos e não foram relatadas circunstâncias ambientais que pudessem causar dispneia (por exemplo, tabaco, exposição a solventes orgânicos, poeira). O exame físico mostrou um cão responsivo, mas letárgico, com fraqueza generalizada, dispneia grave, membranas mucosas cianóticas, tempo de preenchimento capilar prolongado, pulsações periféricas fracas, taquicardia (frequência cardíaca de 180 batimentos/min) e um murmúrio sistólico de grau um de seis, com o ponto de intensidade máxima sobre o ápice cardíaco direito. Sons pulmonares agudos foram ouvidos na auscultação pulmonar. A contagem completa de células sanguíneas (CBC) mostrou uma leucocitose madura leve (glóbulos brancos: 18,9 × 109/L; intervalo de referência 4,5–14,6 × 109/L) e um hematócrito de 56% (intervalo de referência 42–61%). A bioquímica não mostrou anormalidades. A análise de gases arteriais mostrou uma hipoxemia grave (PaO2: 48,5 mm Hg; intervalo de referência 85–103 mm Hg) e uma hipocapnia leve (PaCO2: 27,0 mm Hg; intervalo de referência: 32–43 mm Hg). A causa suspeita para a hipocapnia foi a hiperventilação. As concentrações de D-dímero e antitrombina estavam dentro dos intervalos de referência. O teste de antigénio de dirofilária immitis (SNAP® Heartworm RT Test, IDEXX Laboratories) e o exame fecal (técnica de flotação e isolamento larvar de Baermann) foram ambos negativos. As radiografias torácicas mostraram dilatação do tronco da artéria pulmonar e cardiomegalia do lado direito A ecocardiografia foi muito complicada devido à ansiedade e respiração ofegante do cão e, por isso, foi limitada. Mostrou dilatação severa do ventrículo direito, dilatação uniforme e leve da artéria pulmonar principal, achatamento sistólico do septo interventricular e regurgitação tricúspide moderada. A aplicação da equação de Bernoulli modificada à velocidade do jato de regurgitação tricúspide mostrou uma pressão sistólica estimada da artéria pulmonar de 77 mmHg, classificada como PH grave (referência < 25 mmHg, grave > 75 mmHg) ([]) As dimensões do ventrículo esquerdo foram marcadamente reduzidas, consistentes com depleção de volume do lado esquerdo. Foi realizada uma ecocardiografia com contraste salino, que foi negativa, excluindo assim a derivação intra e extra cardíaca direita-esquerda. Para resolver a hipoxemia grave e a PH, o cão foi colocado numa gaiola de oxigénio com uma concentração de oxigénio inspirada entre 40 e 50%. Além disso, foram administrados 1,5 mg/kg/8 h de sildenafil oral (Viagra®, Pfizer, Nova Iorque, EUA) e 0,25 mg/kg/12 h de pimobendan oral (Vetmedin®, Boehringer Ingelheim, Alemanha). Esta terapia não afetou significativamente o estado clínico do cão. No entanto, a hipoxemia arterial melhorou ligeiramente após o primeiro dia de terapia (PaO2 aumentou de 48,5 para 53 mmHg, intervalo de referência 85-103 mmHg). O ecocardiograma foi repetido no terceiro dia de terapia e as alterações ecocardiográficas e a gravidade da PH foram significativamente reduzidas. A dilatação do ventrículo direito diminuiu drasticamente, o septo interventricular deixou de ser achatado e o gradiente de pressão da regurgitação tricúspide diminuiu de 77 mmHg para 41 mmHg (referência < 25 mmHg). Por conseguinte, a terapia com pimobendan e sildenafil foi continuada durante o período de hospitalização (7 dias). Como passos de diagnóstico adicionais, uma tomografia computadorizada (TC) (pré e pós-contraste) com apneia, seguida de uma biópsia pulmonar cirúrgica na mesma sessão de anestesia, foram realizadas 4 dias após a apresentação inicial. Foi utilizado um tomógrafo helicoidal de 3 mm (Philips Secura, Philips NV, Eindhoven, Países Baixos). As definições técnicas incluíam fatias helicoidais de 3 mm, 120 kV, 200 mA, 292 mm de campo de visão, 512 × 512 de matriz e um algoritmo de alta frequência espacial. Nas imagens de TC, o parênquima pulmonar mostrou nódulos de vidro fosco centrolobulares sutis e uma artéria pulmonar alargada. As linhas septais, o derrame pleural e a linfadenopatia estavam ausentes. Os achados de TC foram compatíveis com PH sem um diagnóstico conclusivo. Após a tomografia computadorizada, foi realizada uma biópsia pulmonar do lobo pulmonar esquerdo (3 × 2 cm) para exame histopatológico com uma mini-toracotomia. Imediatamente após este procedimento, foi iniciada uma terapia com dexametasona (0,25 mg/kg q24 h I.V., Rapidexon ®, Eurovet Animal Health, Bladel, Países Baixos) como último recurso enquanto os resultados histopatológicos estavam pendentes (3 dias). A histopatologia da biópsia cirúrgica do pulmão mostrou uma pneumonia histiocítica intersticial crônica moderada de etiologia desconhecida e atelectasia por hematoxilina e eosina, ácido periódico-Schiff e coloração de Van Gieson. As alterações vasculares não foram inicialmente claramente identificadas. Devido à fraca resposta ao tratamento iniciado e ao suspeito mau prognóstico com base nos resultados histopatológicos, o cão foi eutanasiado. A autópsia foi realizada com o consentimento informado do proprietário. A patologia bruta dos pulmões mostrou pulmões firmes moderadamente colapsados com uma aparência difusa e manchada com múltiplos focos vermelhos escuros de 1 × 1 × 3 mm, e pequenos números de focos brancos de 1 × 1 × 1 mm, muitas vezes rodeados por uma zona vermelha escura (demarcação) distribuída aleatoriamente por todos os lobos pulmonares. A histopatologia rotineira dos pulmões mostrou remodelação vascular multifocal. Para diferenciar entre pequenas artérias e veias, essencial para diagnosticar a PVOD, foi adicionada uma mancha que visualiza as fibras elásticas e o colagénio (Resorcin Fuchsin de Weigert) para identificar as lâminas elásticas. Neste cão, tal como nas pessoas com PVOD, os três compartimentos (artérias, veias e capilares) da microcirculação pulmonar foram afetados, embora as alterações no sistema venoso pulmonar tenham sido as mais pronunciadas. As lesões venulares incluíram uma proliferação intimal concêntrica grave, a obliteração parcial ou total dos lúmens e a recanalização pós-trombótica. As lesões capilares foram organizadas em focos, mais óbvios adjacentes às veias remodeladas e foram caracterizadas por proliferação de células endoteliais de extremidade (semelhantes às PCH). A congestão segmental dos capilares alveolares foi também regularmente associada aos focos de PCH. As lesões arteriais assemelharam-se às de PAH com espessamento intimal concêntrico por aumento da matriz extracelular e hipertrofia média, mas as lesões plexiformes complexas estiveram ausentes. Estes achados foram consistentes com os achados descritos por Williams et al. [] e, portanto, com o equivalente humano da PVOD. O DNA genômico do caso foi isolado de sangue com EDTA usando um robô de extração semi-automatizado Chemagen (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH) e foi armazenado a -20 °C. Aproximadamente 6 anos depois, o DNA genômico do caso e um GSD saudável não relacionado foram analisados por sequenciamento do genoma completo. A integridade do DNA foi verificada em um Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, EUA) e quantificada usando Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). As bibliotecas de DNA foram preparadas usando o kit de preparação de biblioteca TruSeq Nano (kit de preparação de biblioteca TruSeq Nano, Illumina, San Diego CA, EUA) usando 200 ng de entrada de gDNA. As informações de sequenciamento do genoma completo com cobertura de 30x foram obtidas usando um instrumento HiSeqX Ten (instrumento HiSeqX Ten, Illumina, San Diego CA, EUA) e 2 × 150 pares de bases de leitura de extremidade emparelhada. Os dados foram processados com o nosso pipeline desenvolvido internamente v1.2.1 () incluindo análise de mutação somática (Strelka, VarScan, FreeBayes, e MuTect) e um kit de ferramentas de análise de genoma (GATK v. 3.2.2) [] de acordo com as diretrizes de melhores práticas []. As leituras de sequência foram mapeadas contra o Genoma de Referência Canino (CanFam 3.1) utilizando o alinhamento Burrows-Wheeler com correspondências exatas máximas (BWA-MEM) v0.7.5a [] seguido por duplicações marcadas, fusão de pistas e realinhamento de indels. A calibração de base não foi realizada. Na medicina humana, as mutações em BMPR2, ACVRL1, ENG, KCNK3, CAV-1, e SMAD9 foram sugeridas como sendo causadoras de uma forma dominante autossómica de PAH [] Estes genes foram incluídos nas análises para evitar a falta de mutações candidatas devido a uma classificação fenotípica errada. Comparando o caso e o controlo, a análise destes genes revelou 196 variantes intrónicas únicas. Comparando a sequência de EIF2AK4 no caso e no GSD saudável, foram reveladas 124 variantes únicas, das quais 9 estavam localizadas na 3`-UTR, 112 eram variantes intrónicas e 3 eram variantes exónicas. O caso foi homozigótico para c.2961T>C e c.1266G>A, foi encontrada uma variação heterozigótica em c.2092G>A. A validação da variante foi realizada por sequenciamento Sanger em produtos de reação em cadeia da polimerase amplificados a partir de ADN genómico utilizando Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Após o tratamento com exonuclease I, as reações de sequenciamento foram realizadas utilizando BigDye v3.1, sequenciadas num ABI3130XL e analisadas em Lasergene (versão 12.0 DNASTAR). Quatro dos cinco GSD adicionais, desconhecidos para qualquer forma de stress respiratório e com idades ≥ 10 anos, revelaram o genótipo idêntico ao caso e, por conseguinte, foram excluídos como variantes causadoras de PVOD.