Um eurásio de 4 anos de idade, nascido em 2015 no "Sendaviva, Natural Park of Navarra" (42°11′31″N, 1°09′54”O) (Noroeste da Espanha) foi transferido para o parque de vida selvagem "Terra Natura" (Sudoeste da Espanha) em 2017. O parque de vida selvagem "Terra Natura" está localizado nas imediações da cidade de Múrcia (38°00′40″N, 1°09′54”O). O recinto das lontras consistia numa área com abrigos de acesso livre e um lago com 4 animais desta espécie (2 machos e 2 fêmeas). Não foi aplicado nenhum insecticida para combater as moscas-das-flores às lontras. Em agosto de 2019, o animal apresentou epistaxe bilateral, anorexia, apatia e perda de peso realizado conforme descrito por Cantos-Barreda et al. []. Para testar que o ensaio TR-IFMA validado para o soro do cão pode ser aplicado ao soro da lontra, foi realizado um Western blot. O Western blot foi realizado em soros de lontra com sinais compatíveis com leishmaniose e de um cão seropositivo para Leishmania por TR-IFMA. Os soros (dilução 1:2000) foram separados em condições redutoras em mini gel de poliacrilamida (0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 12% de gel de resolução e 4% de gel de empilhamento). As proteínas resolvidas foram eletrofotograficamente transferidas para uma folha de nitrocelulose (Bio-Rad, EUA) e colocadas num substrato ROTI®Lumin (Carl Roth, Alemanha) para bloquear durante 2 h à temperatura ambiente. O anticorpo policlonal de ovelha anti-IgG2 de cão (AHP498; Bio-Rad, EUA) foi utilizado como anticorpo primário numa diluição de 1:1000 e o anticorpo anti-IgG2 de ovelha conjugado com peróxido de rábano (HRP) de cão (SAB3700702; Sigma-Aldrich, EUA) foi utilizado como anticorpo secundário para detetar o anticorpo primário ligado. A deteção do sinal foi feita com um kit Pierce ECL2 (Pierce, Thermo Fisher Scientific, EUA) e foi digitalizada num scanner Typhoon 9410 (GE Healthcare, EUA). Observou-se uma banda de aproximadamente 150 kDa na amostra de lontra e na amostra de cão (ver figura e ficheiro adicional). Estes resultados corroboraram que o ensaio TR-IFMA utilizando anticorpo policlonal anti-IgG2 de ovelha foi capaz de detetar a IgG2 da lontra. O ensaio TR-IFMA consistiu num método indireto não competitivo baseado num antigénio recombinante biotinilado K39 como reagente de captura e anticorpo policlonal anti-IgG2 de ovelha (Ovelha anti-IgG2 de ovelha, Bio-Rad, EUA) marcado com Eu3+ como anticorpo detector. O teste incluiu soro de um cão seropositivo para Leishmania como controlo positivo e soro de um cão seronegativo para Leishmania como controlo negativo. A análise foi realizada num contador de múltiplos marcadores (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finlândia). Os resultados foram expressos como unidades de fluorometria para Leishmania (UFL). O limite foi fixado em 22 UFL. Também foi realizado um ensaio imuno-sororente ligado a enzima (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Espanha) para detetar anticorpos IgG específicos contra Leishmania spp. de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de soro foram diluídas 1:20 e os resultados foram expressos como relação de amostra para positivo (S/P), calculada pela densidade óptica (OD) da amostra/OD do controlo positivo baixo. Valores de S/P acima de 1,1 foram considerados positivos. A presença de DNA de Leishmania spp. no sangue total e na medula óssea foi avaliada por amplificação da sequência de DNA de cinetoplasto de Leishmania spp. utilizando uma rtPCR com primers e sondas previamente descritas []. A medula óssea foi retirada através de aspiração com agulha fina da união costocondral e drenada para um tubo de 1 ml revestido com EDTA. O DNA foi extraído utilizando o Kit de Preparação de Amostras de PCR de Alta Pureza (Roche, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. A rtPCR foi realizada num volume final de 20 μL, incluindo 1× TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, EUA). O reagente de controlo interno foi incluído. A rtPCR foi realizada num volume final de 20 μL, incluindo 1× TaqMan Universal Probe Supermix (Bio-Rad, CA, EUA), 900 nM de cada primer, 200 nM de sonda TaqMan, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA e 50 ng de DNA de cada amostra. Os parâmetros de ciclagem foram: 50 °C durante 30 s, 95 °C durante 10 min, 45 ciclos a 94 °C durante 30 s e 55 °C durante 1 min. Cada ciclo de amplificação incluiu controlos positivos e negativos, e cada medição foi realizada em triplicado. Para a identificação da espécie de Leishmania, os produtos de PCR das amostras positivas foram purificados utilizando o Kit de Purificação de Produtos de PCR de Alta Pureza (Roche, Alemanha) e submetidos a sequenciação na Secção de Biologia Molecular da Universidade de Múrcia. As sequências obtidas foram comparadas com as disponíveis no GenBank. Além disso, como controle negativo, as mesmas análises foram realizadas em uma lontra eurasiana de três anos de idade do mesmo parque de vida selvagem sem sinais clínicos compatíveis com leishmaniose. Todos os resultados aparecem na Tabela. A ocorrência de leishmaniose foi confirmada, e um tratamento específico foi administrado (allopurinol 15 mg/kg/24 h/p.o.). O monitoramento do tratamento foi realizado, em novembro de 2019, após 3 meses de tratamento. Nefropatia bilateral com hidronefrose, linfadenomegalia mesentérica, e ascites foram observadas. O CBC revelou diminuições de glóbulos brancos, e diminuições de plaquetas na lontra positiva para Leishmania. O perfil bioquímico sérico para a lontra positiva para Leishmania mostrou hiperproteinemia, hiperglobulinemia, diminuições de PON-1, e aumentos de haptoglobina e ferritina. A análise de urina revelou proteinúria e diminuições na osmolaridade e gravidade específica. A presença de anticorpos IgG2 anti-Leishmania, e um resultado positivo por rtPCR em termos de sangue total e medula óssea, foi observada para a lontra positiva para Leishmania. O sequenciamento de amostras positivas confirmou a identificação de L. infantum. A sequência amplificada exibiu 100% de similaridade com uma sequência de referência de L. infantum. Além disso, microorganismos ovais com um núcleo excêntrico compatível com amastigotes de Leishmania spp. foram observados na citologia do baço (Fig.