Uma mulher de 52 anos com histórico de colecistectomia e ressecção parcial do lobo hepático esquerdo em 2004 devido a cálculos biliares sintomáticos e múltiplas metástases intra-hepáticas do ducto biliar, teve febre intermitente e icterícia progressiva desde o início de Novembro de 2014. A obstrução do ducto biliar e uma suspeita de malignidade hepática foram detectadas através de ultrassom subsequente, ressonância magnética de colangiopancreatografia (MRC), ressonância magnética, e tomografia por emissão de positrões (PET-CT). A laparotomia exploratória foi realizada no final de Novembro de 2014 (Ficheiro adicional: Figura S1) e encontrou uma adesão intra-abdominal grave, um nódulo (1 × 2 cm) com textura endurecida no ducto hepático esquerdo proximal, e metástases hepáticas disseminadas que infiltravam o hilus do ducto hepático comum, o ligamento hepatoduodenal, os linfonodos circundantes, a artéria hepática, a veia porta, e o eixo celíaco. Estes achados obrigaram os cirurgiões a desistir da ressecção radical. Bile purulenta foi descarregada do ducto comum, e um tampão de muco projetou-se da parede do ducto biliar. Metástases neoplásicas parciais foram removidas dos linfonodos alargados, do nódulo do ducto hepático esquerdo, e da margem do ducto hepático comum para exame patológico. O duto de drenagem foi instalado para alívio da obstrução biliar. Os relatórios patológicos revelaram que a natureza do tumor era um adenocarcinoma mal diferenciado com marcadores de diferenciação de colangócitos; além disso, a expressão moderada de EGFR foi detetada em >90% das células tumorais. Esta paciente foi finalmente diagnosticada com CCA periférico avançado. Cinco semanas após a cirurgia paliativa, a paciente recebeu um ciclo de 4 semanas de terapia TOMO no tumor maligno hilar (DT = 60 Gy/25 F), um ciclo de quimioterapia sistemática com paclitaxel ligado a albumina para as suas intoleráveis toxicidades gastrointestinais e a infusão de células assassinas induzidas por citoquinas autólogas. Devido ao aumento progressivo de CA199, o PET-CT foi re-examinado imediatamente após a conclusão da radioterapia e mostrou uma nova lesão hipermetabólica metastática no lobo caudal hepático e metástases de tecidos moles e linfáticos retroperitoneais com valores de captação padronizados anormais (SUV) entre o fígado e o estômago quando comparados com o PET-CT antes da radioterapia. Quatro semanas após a radioterapia, a paciente foi inscrita no estudo CART-EGFR. O seu desempenho foi classificado como 1 de acordo com os critérios do Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Durante a preparação das células CART-EGFR, desenvolveu febre alta, icterícia agressiva, e obstrução do ducto biliar, acompanhada pela elevação contínua de CA199 (de 100,5 para 413,5 U/ml), aumento agressivo da bilirrubina total, bilirrubina direta, e outros índices de obstrução biliar relacionados com a enzima, e foi tratada com antibióticos de largo espectro eficazes e colocação de stent biliar endoscópico nos ductos biliares hepáticos. Os ensaios (identificador ClinicalTrials.gov NCT01869166, NCT02541370) foram aprovados pelo Institutional Review Board no Hospital Geral do Exército Chinês. Nenhum patrocinador comercial esteve envolvido nos estudos. Os pacientes inscritos forneceram consentimento informado por escrito de acordo com a Declaração de Helsinque. A sequência de ADN do fragmento de cadeia única variável (scFv) que tem como alvo o antigénio EGFR foi derivada do JQ306330.1 (GenBank Number). O CAR anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta foi gerado e clonado no esqueleto lentiviral pWPT, descrito em detalhe por Feng et al. []. A construção foi verificada por sequenciamento de ADN. Um pseudotipado, vector lentiviral de grau clínico foi produzido por transfecção transitória padrão como descrito por McGinley et al. [] De acordo com as instruções do fabricante do reagente de transfecção Lipofectamine 3000 (Invitrogen, EUA), o plasmídeo pWPT-anti-EGFR CAR, o plasmídeo de empacotamento ps-PAX2 e o plasmídeo de envelope pMD2.G foram transfectados em células 293 T. Os sobrenadantes lentivirais foram recolhidos e armazenados a -80°C. O vector GFP-CD137-CD3zeta foi construído para verificar a eficiência da transdução por meio de citometria de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). A sequência de ADN do scFv que tem como alvo o antigénio CD133 foi derivada do HW350341.1 (GenBank Number), a geração, construção e teste das células CART-EGFR seguiram o mesmo procedimento que as células CART-EGFR (Ficheiro adicional: Figura S2). As células CART foram fabricadas a partir de células mononucleares de sangue periférico autólogo (PBMCs) coletadas em tubos de preparação de células (BD Biosciences, San Jose, CA) purificadas de 80 a 100 ml de sangue total no Centro de Boas Práticas de Fabricação do Hospital Geral do PLA Chinês de acordo com os procedimentos operacionais padrão em vigor. As PBMCs foram estimuladas com 50 ng/ml de anti-CD3 MoAb (Takara, Japão) e 500 U/ml de interleucina-2 humana recombinante (Peprotech, EUA) em meio GT-T551 (Takara). A transdução lentiviral foi realizada em meio GT-T551 com sulfato de protamina (Sigma) durante 24 h após 2 dias de cultura de células T. Depois disso, as células foram expandidas em sacos de cultura (Takara) e colhidas como células CART. As bactérias, fungos e endotoxina foram testados antes da infusão de células CART. O imunofenótipo das células CART foi analisado por citometria de fluxo com anticorpos fluorescentes específicos para a coloração de CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L e CCR7. Para a coloração de controlo, foram utilizados anticorpos monoclonais correspondentes ao isótipo (BD Biosciences). A expressão de CAR foi estimada com base nas células transduzidas com GFP-CD137-CD3zeta no mesmo lote para todos os pacientes por citometria de fluxo. A aquisição e análise de dados foram realizadas utilizando uma citometria de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). A citotoxicidade in vitro das células CART-EGFR foi testada por co-cultura com células tumorais positivas para EGFR em várias relações de efector para alvo em placas de 96 poços utilizando um kit de Detecção CCK-8 de 4 h (DOJINDO, Japão). A PCR quantitativa em tempo real (Q-PCR) foi empregada para avaliar o nível do gene de fusão CAR de acordo com um protocolo previamente descrito.13 Um fragmento de 153 pb (pares de bases) que contém porções da cadeia CD8a e da cadeia 4-1BB adjacente (o iniciador direto 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ e o iniciador inverso 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) foi amplificado pelo Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Beta-actina foi usada como um controle interno. Uma curva padrão de 7 pontos que consistia de 100 a 108 cópias/μl de DNA plasmidial contendo o gene CAR foi preparada. Soro IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF, e Granzyme B foram testados utilizando um imunoensaio de sanduíche de microesferas BD Biosciences de acordo com as instruções do fabricante. De acordo com o sistema de cultivo, conforme relatado anteriormente [], as células CART-EGFR foram geradas a partir das células mononucleares de 80-100 ml do sangue periférico do paciente e liberadas para as infusões. Das células infundidas durante o primeiro ciclo de terapia CART-EGFR, 99,14% foram células CD3+, compostas principalmente pelo subconjunto CD8+ (62,26%), e 23,61% foram caracterizadas com o fenótipo de memória central (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Além disso, 8,99% das células infundidas foram positivas para EGFR. O fenótipo e a eficiência de transfecção das células CART-EGFR infundidas em cada ciclo estão documentados na Tabela. As células CART133 foram geradas e cultivadas de acordo com o mesmo procedimento das células CART-EGFR. Das células infundidas, 95,2% foram células CD3+, compostas principalmente pelo subconjunto CD8+ (71,9%), e 41,9% foram células CD45RO+/CD62L+/CCR7+. Além disso, 6,4% das células infundidas foram células CD133 positivas. Os detalhes estão documentados na Tabela. Devido à radioterapia recentemente concluída no prazo de 2 meses e intolerância a agentes quimioterápicos, a paciente recebeu infusões sucessivas de 4 dias de 2,2 × 106/kg de células CART-EGFR no total sem qualquer terapia de condicionamento, e alcançou um PR na sua primeira avaliação 6 semanas depois, avaliada de acordo com os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos versão 1.1 (RECIST 1.1) com MRI e PET-CT, que ilustrou uma redução de mais de 80% de lesões metastáticas na região hepática hilar e no lobo caudado e um declínio notável do SUV, juntamente com uma diminuição rápida de CA199 de 413,5 para 123,1 U/ml. O número de cópias do transgene CAR no sangue periférico da paciente atingiu um pico de 5916 pg/dl no dia 9, acompanhado com a libertação de citocinas, tais como interleucina-6 (IL-6) e proteína reativa C (CRP). O segundo ciclo de monoterapia CART-EGFR foi administrado com uma dose de células T que expressam EGFR-CAR+ de 2,1 × 106/kg e sem qualquer tratamento de pré-condicionamento, porque o número de cópias do transgene CAR no sangue periférico diminuiu para perto do nível de referência 2 meses após a primeira infusão de células T geneticamente modificadas que expressam CART-EGFR. Os exames de rotina de MRI e PET-CT mostraram um PR persistente acompanhado com uma redução adicional de CA199 para 61,2 U/ml. É interessante notar que o pico do número de cópias do transgene CAR após a segunda infusão de células CART-EGFR não atingiu um nível paralelo ou superior ao do primeiro ciclo de terapia CART-EGFR. O estado PR da paciente foi mantido durante 8,5 meses até que ela desenvolveu vómitos frequentes e intratáveis, dor abdominal superior e refluxo gástrico, que ocorreram em meados de Novembro de 2015. A subsequente gastroscopia eletrónica mostrou estenose do bulbo duodenal e o PET-CT confirmou a progressão do tumor com ilustração de múltiplas novas lesões anormais SUV na omento maior, peritoneu e cavidade abdominal. Subsequentemente, o paciente foi tratado com 1 ciclo de terapia CART-EGFR combinado com 2 ciclos de anticorpo monoclonal anti-proteína de morte celular programada 1 (PD-1) (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), que foi administrado numa dose de 100 mg a cada 2 semanas. Da mesma forma, o número de cópias do transgene CAR monitorado no sangue periférico não atingiu um nível de pico semelhante ao da infusão do primeiro ciclo, mesmo combinado com anticorpo anti-PD-1. Apesar do CA199 no soro ter diminuído temporariamente de 326.3 para 210.8 U/ml, o seguinte PET-CT detetou novas metástases emergentes no fundo da pélvis, lóbulo direito do fígado e nódulo linfático supraclavicular esquerdo, bem como o alargamento de lesões tumorais anteriores no abdómen quando comparado com o PET-CT antes da imunoterapia combinada. Como mais de 90% das células tumorais expressaram a proteína CD133 (Ficheiro adicional: Figura S3), a paciente foi então inscrita no estudo CART133 e recebeu a infusão de 1.22 × 106/kg de células CART específicas de CD133 sem tratamento de condicionamento. Como ocorreu a obstrução no duodeno descendente e a consequente infecção persistente grave do trato biliar, bem como um abcesso hepático, que pode interferir com o nível de CA199 sérico e foi tratado com antibióticos, a avaliação de imagem programada foi adiada para 2 meses após a infusão de células CART133, em que a TC com contraste de imagem mostrou uma redução notável ou mesmo desaparecimento de algumas metástases no peritoneu e na cavidade abdominal, levando a uma avaliação de PR e hemoculturas, que não apoiaram o diagnóstico de infecção, mas, entretanto, a escalada de IL-6 e CRP e o aumento agudo de glutamato-pirúvico transaminase e glutamato-oxalacetato transaminase (>6ULN). Apareceram algumas erupções cutâneas minúsculas espalhadas na coxa esquerda 2 semanas após a infusão do primeiro ciclo de células CART-EGFR, que gradualmente se agravaram e se tornaram aparentes e pruriginosas com a apresentação de múltiplas erupções cutâneas escamosas ou lineares que se espalhavam da coxa esquerda para a panturrilha e se fundiam, que foi classificada como grau 2 de acordo com os critérios comuns de terminologia para eventos adversos 4.0 (CTCAE 4.0), quando o segundo ciclo de imunoterapia CART foi cumprido. As erupções cutâneas foram biopsiadas com ilustração de alterações patológicas do tipo líquen estriado, tais como a perda de epiderme parcial, degeneração vacuolar de células basais e infiltração de numerosos linfócitos T na epiderme e seus apêndices, e foram geridas com sucesso com pomada de tacrolimus. Não ocorreu hipotensão durante todo o tratamento CART-EGFR. Exceto por náuseas, vômitos, calafrios, febre e fadiga, não houve outros eventos adversos agudos no curso do tratamento combinado. Embora a caspa tenha aparecido e piorado após a imunoterapia combinada, não houve necessidade de intervenções médicas. Os níveis séricos de citocinas, como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), IL-6 e CRP, elevaram-se ligeiramente e não induziram quaisquer sintomas de liberação de citocinas. Durante a infusão de sucessivas doses crescentes de CART133 ao longo de 4 dias, não houve quaisquer outros eventos adversos exceto febre ligeira e fadiga relacionadas com a infusão. No entanto, na segunda manhã após a conclusão da infusão de CART133, esta paciente desenvolveu dor abdominal superior, calafrios, febre (39.1 °C), hemorragias esporádicas e erupções cutâneas nos seus gémeos, que se espalharam rapidamente e difusamente para o seu pescoço, braço superior direito, peito, abdómen esquerdo e mucosa retrofaríngea acompanhada por prurido e diarreia nessa tarde e que se deteriorou ainda mais nos 10 dias seguintes e ligando da proteína de morte celular programada 1 (PD-L1) [,], resultando numa rápida perda da sua capacidade de secreção citolítica e de citoquinas e numa entrada num estado de hiporesposta [] Além disso, os tumores sólidos demonstram frequentemente aberrações metabólicas por consumo excessivo de aminoácidos essenciais críticos para a atividade das células T e induzem a hipóxia e a acidificação resultante da matriz extracelular devido a um fornecimento vascular insuficiente, que é hostil à sobrevivência das células T [] Assim, a modulação do microambiente do tumor é necessária para melhorar os resultados. Neste caso, apesar do facto de a paciente não ter recebido qualquer tratamento de condicionamento direto com o objetivo de transformar o microambiente do tumor, foi tratada com 60 Gy de radioterapia antes da imunoterapia com um intervalo de aproximadamente 1 mês entre o final da radioterapia e o início da infusão de células CART. Embora a radioterapia em si não tenha conseguido erradicar efetivamente as células tumorais, o seu efeito direto e retardado pode desempenhar um papel na destruição do estroma de suporte do tumor, alterando a biologia do microambiente do tumor, promovendo a libertação de mais antígenos associados ao tumor e aumentando o reconhecimento imunológico [] Além disso, a radioterapia pode tornar os tumores mais imunogênicos e mais suscetíveis a um ataque melhorado pelas células T [], e pode mesmo gerar efeitos antitumorais nessas metástases distantes que não foram irradiadas localmente (referidas como efeito abscopal) [, ]. Assim, apresentamos a hipótese de que a radioterapia pode ser uma terapia de condicionamento razoável e eficaz para melhorar o resultado da terapia CART. Quando a resistência à terapia CART-EGFR foi confirmada, uma vez tentamos uma combinação de imunoterapia com anticorpo anti-PD-1 em conjunto com infusão de células CART-EGFR com base num estudo pré-clínico que o bloqueio da imunossupressão por PD-1 poderia aumentar significativamente a eficácia terapêutica da terapia com células CART contra tumores sólidos estabelecidos []. Infelizmente, este tratamento terminou com um fracasso, com PET-CT a verificar a progressão da doença, embora o CA199 tenha diminuído de forma transitória. Uma possível explicação é o nível pouco claro de expressão de PD-L1. Recentemente, a expressão de PD-L1 é destacada pelo seu valor na previsão dos efeitos terapêuticos de fármacos anti-PD-1. No entanto, a lesão tumoral neste caso foi difícil de biopsiar devido à sua localização anatómica, o que fez com que o nível de expressão da proteína PD-L1 nas células tumorais não pudesse ser detetado com precisão antes do início da terapia anti-PD-1, o que fez com que existisse a possibilidade de a expressão de PD-L1 no meio tumoral ser de nível baixo ou mesmo negativo e, por conseguinte, levar ao fracasso do tratamento anti-PD-1. Entretanto, existiam muitas outras vias de controlo de pontos paralelas que poderiam potencialmente apoiar a resistência à terapia anti-PD-1 [] Sob esta situação, a seleção de um alvo racional foi crucial para o próximo passo do tratamento dos pacientes. Recentemente, as CSCs em CCA atraíram grande atenção pelas suas propriedades altamente carcinogénicas e papéis fundamentais na mediação da auto-renovação, re-crescimento do tumor e resistência terapêutica, consequentemente, a terapia que visava marcadores moleculares de superfície e vias de sinalização específicas para CSC seria uma opção potente para CCA [, ]. Entre as moléculas usadas individualmente ou em combinação para identificar células estaminais de colangiocarcinoma, o CD133 é um dos marcadores de células estaminais mais importantes que estão associados a uma invasividade superior e a um prognóstico mais pobre [] Shien e colegas também relataram que as células tumorais CD133 positivas mostraram maior resistência ao tratamento pós-operatório do que as células CD133 negativas, e observou-se um aumento da expressão de CD133 em células cancerosas residuais após a terapia adjuvante [] Baseado no que foi referido, selecionámos o CD133 como alvo antigénico para a imunoterapia CART, que por sua vez produziu outra resposta parcial, e demonstrou ainda que a imunoterapia com cocktail CART pode ser viável e racional. Outra questão crucial de grande preocupação foi a toxicidade, que poderia ser induzida pelas células CART nos antígenos alvo expressos em células tumorais e/ou de forma síncrona em tecidos normais, denominados de efeito alvo fora do tumor. Danos em tecidos normais podem até ocorrer por uma reação cruzada inesperada com uma proteína que não é expressa em células tumorais []. Desde o início da infusão de células CART-EGFR, este paciente experimentou não só febre, calafrios e fadiga relacionados com a infusão, mas também febre prolongada, elevação aguda das transaminases séricas e aparecimento tardio de erupções cutâneas, acompanhados por uma elevação robusta do número de cópias do transgene CAR, IL-6 e CRP, embora os níveis não tenham cumprido os critérios de diagnóstico de síndrome de libertação de citocinas [, ]. As citocinas maciças que poderiam ser produzidas diretamente pelas células CART infundidas refletiram uma forte resposta imunológica que poderia gerar efeitos antitumorais em células tumorais e efeitos colaterais em tecidos normais. Além disso, o efeito alvo fora do tumor causado pelas células CART-EGFR foi provavelmente a razão para o desencadeamento de toxicidades cutâneas devido à distribuição de EGFR na epiderme []. No entanto, todos estes eventos adversos foram ligeiros, reversíveis e geridos com cuidados de suporte e corticosteroides tópicos. A adição de anticorpo anti-PD-1 não agravou aparentemente as toxicidades da imunoterapia CART-EGFR neste caso. No entanto, no tratamento subsequente da infusão de células CART133, este paciente sofreu toxicidades cutâneas, orais, mucosas e gastrointestinais graves, tais como erupção congestiva e hemorragia. Embora estas toxicidades tenham sido geridas com sucesso por intervenções médicas emergentes, incluindo metilprednisolona intravenosa e inibidor anti-TNF, o mecanismo inerente pode dever-se, em grande parte, ao efeito alvo fora do tumor das células CART133 que visaram o antigénio CD133 expresso no epitélio normal e no endotélio vascular. Entretanto, não ficou claro se o anticorpo anti-PD-1 e as células CART-EGFR residuais in vivo poderiam desempenhar um papel no agravamento das toxicidades da imunoterapia CART133.