Este assunto foi um homem de 22 anos com B-ALL que teve uma terceira recaída da medula óssea (BM) antes de se inscrever no nosso protocolo clínico compassivo usando células TanCAR-T 19. Ele foi diagnosticado com B-ALL com mais de 100 × 109/L de contagem de WBC e cariótipo normal em janeiro de 2016. Após a remissão completa (CR) 2, ele foi submetido a haplo-HSCT do seu pai 10 meses após o diagnóstico original. Ele sofreu cistite hemorrágica e GVHD aguda gastrointestinal de estádio 1 no prazo de 2 meses após o haplo-HSCT, que se resolveu com 15 doses diárias de 50 mg de metilprednisolona, seguidas por 5 doses diárias de 100 mg de metilprednisolona. Três meses após a descontinuação da ciclosporina A e da metilprednisolona, a sua doença reincidiu com 6,4% de blastos da medula óssea quando ainda tinha quimérismo total do dador, progredindo rapidamente com 56,5% de blastos da medula óssea por citometria de fluxo 10,6 meses após o haplo-HSCT, e quimérismo total do dador foi documentado ao mesmo tempo. Ele recebeu quimioterapia de salvamento com MOEP (3 doses diárias de 10 mg de mitoxantrona, 4 mg de vindesina, 3 doses diárias de 100 mg de etoposide, e 5 doses diárias de 15 mg de dexametasona) e teve depressão grave da medula óssea e não resposta com 65,4% de blastos da medula óssea 1 mês após o primeiro ciclo de MOEP. Então, ele foi tratado com o nosso protocolo de células haplo-CAR-T 19. Ele recebeu quimioterapia de citorredução com vindesina e metilprednisolona mais hidroxiureia e linfopenia com 65,4% de blastos da medula óssea 1 mês após a infusão de células haplo-CAR-T 19. As células haplo-CAR-T 19 a uma dose de 4,91 × 106/kg (2,89 × 107 T cells/kg, 17% eficiência de transfecção) foram administradas e induziram MRD-CR (MRD-CR) e quimérismo total do dador dentro de 2 semanas após a infusão. As células haplo-CAR-T 19 infundidas exibiram expansão rápida e atingiram 15,281 cópias por micrograma de ADN nos primeiros 2 dias após a infusão, mas caíram de 3374 cópias por micrograma de ADN no dia 7 para 468 cópias por micrograma de ADN no dia 12; metilprednisolona 160 mg e dexametasona 5 mg foram usadas no dia 11 para tratamento da síndrome de libertação de citoquinas de grau 3 (CRS). Ele experienciou GVHD aguda de grau 3 no prazo de 1 mês após a infusão de células haplo-CAR-T 19, que foi controlada com 5 doses diárias de 40 mg de metilprednisolona mais 80 mg de ciclosporina A administradas a partir do dia 31 após a infusão de células haplo-CAR-T 19. No entanto, 1 mês após a obtenção de MRD-CR, a sua doença exibiu uma floração progressiva com contagem de WBC de 1,59 × 109 para 12,52 × 109/L e correspondente percentagem de blastos circulantes de 1,39 para 67,37% dentro de 2 semanas; a sua medula óssea exibiu proliferação celular altamente ativa com 59,67% de blastos que tinham o padrão de expressão CD19+ CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD58+ CD33- CD20- CD13- CD15-. Ao mesmo tempo, as células haplo-CAR-T 19 indetectáveis e o quimérismo total do dador foram documentados. Neste caso, outras terapias incluindo células TanCAR-T 19/22 em vez de quimioterapia de resgate ou reinfusão de células CAR-T 19 poderiam ser uma potencial opção de tratamento para este paciente devido à fraca resposta à quimioterapia de resgate e fraca persistência de células CAR-T 19 infundidas. No entanto, a carga tumoral elevada e o curto intervalo após a descontinuação de esteróides aumentou muito o risco de falha da geração de células CAR-T autólogas; a progressão florida da doença tornou a espera até que os esteróides diminuíssem menos viável. A terapia com células derivadas de dadores TanCAR-T 19/22 foi uma abordagem ideal para superar este problema, mas, como é sabido, as terapias com células haplo-CAR-T não deveriam ser rotineiramente recomendadas no caso de GVHD prévia que requeresse esteróides, principalmente devido à preocupação com o elevado risco de reativação da GVHD. Após uma análise mais cuidadosa dos benefícios clínicos e riscos da segunda infusão de células haplo-CAR-T, o paciente foi inscrito no nosso protocolo clínico de uso compassivo de células haplo-TanCAR-T 19/22. O seu pai foi submetido a aferese e as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram usadas para preparar as células TanCAR-T 19/22. O paciente recebeu quimioterapia citorredutora com vindesina 4 mg e cinco doses diárias de metilprednisolona 80 mg e três doses diárias de hidroxiureia 3 g, seguidas por quimioterapia linfodepletora com idarubicina numa dose total de 30 mg e ciclofosfamida numa dose total de 3 g. A aspiração de medula óssea planeada após a quimioterapia acima referida e antes da infusão de células haplo-TanCAR-T 19/22 não foi realizada devido ao fraco cumprimento do paciente. Dois dias depois, o paciente foi tratado com células haplo-TanCAR-T 19/22 numa dose total de 4.72 × 106 células TanCAR-T 19/22 por quilograma (3.05 × 107 células T por quilograma, 15% de eficiência de transfecção) administradas através de doses fracionadas (D0, 30%; D1, 70%) por razões de segurança. Os materiais e métodos usados na produção do TanCAR-T 19/22 foram descritos anteriormente [–], com exceção da construção do CAR e da fonte de PBMCs usada para a fabricação das células TanCAR-T 19/22. O TanCAR-19/22 era uma molécula CAR em tandem, consistindo de um anti-CD22 scFv derivado do mAb m971 de camundongo [] e um anti-CD19 scFv derivado do mAb FMC63 de camundongo [], unidos em tandem, a articulação CD8α humana e o domínio transmembrana, e os domínios de sinalização CD137 e CD3z humanos. Um esquemático do TanCAR-19/22 é mostrado na Figura a. As PBMCs usadas para a fabricação das células TanCAR-T 19/22 foram coletadas por leucaferese ao invés de sangue periférico (PB) fresco. A citometria de fluxo foi usada para a determinação da eficiência de transfecção de TanCAR-19/22 e quantificação das células haplo-TanCAR-T 19/22 em amostras clínicas usando um fragmento específico de Biotin-SP-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 (Jackson ImmunoResearch, EUA) e anticorpo PE Streptavidin (BD Biosciences, EUA). As células haplo-TanCAR-T 19/22 em amostras clínicas também foram medidas por qPCR como descrito []. A extensão do enxerto do doador em amostras clínicas foi avaliada utilizando a amplificação de repetições em tandem curtas e a PCR multiplex de marcação por fluorescência combinada com eletroforese capilar, conforme descrito []. Os níveis de interleucina sérica (IL)-2, IL-6, IL-8 e IL-10 e do fator de necrose tumoral alfa foram analisados em lote, conforme descrito []. O protocolo de células BM antes do haplo-TanCAR-T 19/22 mostrou células blásticas predominantes com ausência de precursores normais de células do BM. A citometria de fluxo do BM no dia 14 após a infusão de células haplo-TanCAR-T 19/22 indicou que havia 0,73% de blastos residuais. É importante destacar que esses blastos leucêmicos residuais exibiram o padrão de expressão CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD33+ CD19− CD20−, que não foi detectado pela citometria de fluxo no dia 28 na ausência de terapia adicional. Dado a recuperação incompleta de plaquetas e neutrófilos absolutos no dia 28, esse paciente alcançou um MRD-CRi no dia 28 após a infusão. Não houve evidência de blastos no BM, seja por esfregaço de BM ou por citometria de fluxo em pontos de tempo subsequentes por 14 meses. O BM teve reconstituição da hematopoiese normal no dia 56 com exceção da contagem de plaquetas que ainda não se recuperou a um nível de 36 × 109/L no momento deste relatório. O quimerismo total do doador foi estabelecido no dia 14 após a infusão e permaneceu estável depois disso. Após a infusão, as células haplo-TanCAR-T 19/22 expandiram-se e atingiram um nível de 30.7% de células T circulantes no dia 12, seguido por uma fase de contração com um nível baixo de 0.45% de células T circulantes no dia 28. Isto coincidiu com a eliminação de células B circulantes que foram quase indetectáveis no dia 28 por citometria de fluxo. As células haplo-TanCAR-T 19/22 foram ainda mensuráveis com um nível baixo de 2.29% de células T circulantes e as células B circulantes ainda não se tinham recuperado na altura deste relatório. As células haplo-TanCAR-T 19/22 estiveram também presentes por citometria de fluxo em todos os pontos de tempo de avaliação da resposta em BM obtida na avaliação da resposta, e a aplasia crónica de células B foi documentada. Observou-se uma concordância global entre a expansão e persistência de células haplo-TanCAR-T 19/22 em PB medida por citometria de fluxo e qPCR. Na altura deste relatório, o ADN de TanCAR-19/22 permaneceu detetável por qPCR com 1134 e 396 cópias por micrograma de ADN em PB e BM, respetivamente. Após a infusão de células haplo-TanCAR-T 19/22, ele apresentou CRS grau 3, classificado de acordo com a escala de classificação da UPenn [, ]. A febre de até 38,8 °C ocorreu dentro de 24 horas após a infusão de células haplo-TanCAR-T 19/22, durou 11 dias e se tornou afebril no dia 12 após o tratamento com uma dose mais baixa de tocilizumab de 160 mg (1,6 mg/kg) e etanercept de 50 mg no dia 8. Várias citocinas séricas aumentaram acentuadamente 7 dias após a infusão e quase voltaram aos valores basais no dia 41, onde os níveis de interleucina (IL)-6 atingiram o pico de 3377 pg/mL (88 vezes acima do valor basal) no dia 11. A aspartato aminotransferase e a lactato desidrogenase aumentaram significativamente de 8 a 10 dias após a infusão, atingiram o pico de 1529,1 U/L (38 vezes acima do valor basal) e 2027,8 U/L (13 vezes acima do valor basal) no dia 12, respectivamente, e voltaram aos valores basais no dia 21 com o melhor suporte de cuidados. Ele também apresentou disfunção de coagulação com tempo de tromboplastina parcial ativada prolongado, D-dímero elevado e concentrações de fibrinogênio caídas, bem como vazamento capilar com hipoalbuminemia grau 2, apesar da suplementação intensiva de proteínas durante o CRS, que se resolveu no dia 23. A fase anterior 3 GVHD aguda da pele que estava sob controlo foi reativada e progrediu rapidamente para a fase 4 GVHD da pele com novas ulcerações cutâneas locais, particularmente na pele escrotal e na mucosa oral 11 dias após a infusão de células haplo-TanCAR-T 19/22. A concentração de bilirrubina total no soro aumentou continuamente a partir do dia 12 e aumentou para 134 μmol/L no dia 21. Dada a rápida progressão das manifestações de GVHD da pele e o envolvimento do fígado, a dose mais baixa de metilprednisolona a 20 mg diariamente como a dose inicial com subsequente redução gradual num esforço para equilibrar os benefícios e riscos da imunossupressão sistémica foi implementada a partir do dia 21 e descontinuada no dia 39. A erupção cutânea e a bilirrubina total no soro melhoraram significativamente após esses tratamentos. No entanto, as manifestações de GVHD intestinal de fase 3, incluindo principalmente diarreia, ocorreram a partir do dia 50, e a bilirrubina total no soro elevou-se novamente, sugerindo uma GVHD aguda de grau 3. Dezasseis doses de metilprednisolona 20 mg por dia foram administradas novamente a partir do dia 78, controlando significativamente a diarreia e a bilirrubina total no soro. Este paciente apresentou subsequentemente GVHD crônica moderada, manifestada principalmente como esclerodermia, diarreia e perda de peso. A trombocitopenia persistente com contagem de plaquetas que variava de 15 × 109 a 43 × 109/L sem transfusão de plaquetas poderia ser reconhecida como uma manifestação de GVHD crônica no contexto da reconstituição da hematopoiese normal. O tratamento imunossupressivo sistémico foi reduzido em 2 meses com 4 mg de metilprednisolona em dias alternados e 5 mg de metotrexato uma vez por semana e 1 mg de sirolimus diariamente como dose mínima de manutenção a partir do dia 154 até ao momento deste relatório, mantendo a GVHD crônica sob bom controlo.