Uma mulher de 47 anos (peso: 62 kg) foi diagnosticada com hepatite B ativa crônica HBeAg-positiva em 1996. Parâmetros virais, tais como HBeAg, anti-HBe IgG e carga viral plasmática do HBV de amostras congeladas foram simultaneamente medidos por um único operador para reduzir as variações intra e inter-ensaio. HBeAg e anti-HBe foram determinados por eletroquimioluminescência (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). Os níveis de carga viral do HBV foram determinados por PCR em tempo real (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, intervalo dinâmico de 30 IU/ml a 110,000,000 IU/ml) []. A inflamação do fígado foi determinada pelos níveis de alanina aminotransferase (ALT) no soro. Para análise de sequência, os genes pol e preC-core do HBV foram sequenciados com os primers como descrito anteriormente []. A análise foi realizada utilizando um instrumento ABI3100 (Applied Biosystems), e as sequências introduzidas neste trabalho, bem como as obtidas da base de dados GenBank, foram alinhadas com o ClustalX v1.83 [] e editadas com o Bioedit v7.0.9.0 [] O genótipo do HBV foi avaliado por inferência filogenética utilizando o algoritmo Neighbor-joining com o modelo de evolução molecular de dois parâmetros de Kimura no software MEGA v3.1 [] Sequências de ambos os genes foram obtidas em diferentes momentos durante a terapia antiviral. Foi realizado um análise clonal mais detalhado do gene pol do HBV em sete isolados virais selecionados de amostras de soro colhidas durante terapias sequenciais. Cada produto de PCR selecionado do gene pol foi clonado no vetor pGEM-T Easy de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Wisconsin, EUA) e pelo menos 15 clones foram analisados por sequenciamento. Isto permitiu analisar a evolução das quasiespecies virais sob as sucessivas pressões antiviral com base na análise do gene pol. As intervenções de tratamento anti-HBV acompanhadas pela carga viral de HBV e pela cinética do nível ALT são representadas na figura. A terapia foi iniciada quando a carga viral de HBV subiu para 6.5 × 106 IU/ml. Em 1998, quando o paciente foi tratado com IFN-alfa 5 MU três vezes por semana durante 30 semanas, o nível de ADN de HBV foi inferior ao limite de deteção. Esta terapia foi interrompida e substituída em 1999 por lamivudina (150 mg uma vez por dia). Após 2 anos de tratamento contínuo, o ADN de HBV foi detetável (15.5 × 106 IU/ml). O HBeAg permaneceu negativo com anti-HBe detetável durante este período de tratamento. Em 2001, após uma interrupção de 6 meses, o nível de ADN de HBV evidenciou um surto pós-tratamento (1 × 108 IU/ml). No final de 2003, a terapia com lamivudina foi reintroduzida (150 mg uma vez por dia). Foi acompanhada por um evento raro de reversão para um perfil HBeAg-positivo/anti-HBe negativo, que permaneceu detetável durante dois anos. A carga viral atingiu 3.1 × 106 IU/ml neste ponto. Dez meses depois, em 2006, o regime de lamivudina foi substituído por adefovir monoterapia (10 mg/dia). Inicialmente, os níveis de carga viral foram baixos (8.5 × 104 IU/ml) mas após 48 semanas de terapia estes níveis atingiram 7.15 × 106 IU/ml. Os níveis ALT foram normais durante este intervalo. Reativação da replicação do HBV foi assumida considerando a detecção simultânea de HBeAg/anti-HBe [] e a alta replicação detectada. A concordância de HBeAg e anti-HBe não parece ser incomum entre os pacientes que nunca foram tratados com antiviral, mas a sua prevalência em pacientes experientes em terapia é desconhecida. Este padrão sorológico tem sido relacionado a extenso dano hepático e lesão hepática imunomediada grave e consequente disfunção [] Seis meses depois, o nível ALT aumentou ligeiramente (1.5 × limite superior normal - UNL -) e a monoterapia com entecavir foi instituída (1 mg diariamente). Após 5 meses de monoterapia com entecavir, o tenofovir (300 mg uma vez ao dia) foi adicionado ao regime de tratamento para dupla terapia. O DNA do HBV diminuiu para 1 × 105 IU/ml durante quatro meses, mas três meses depois a carga viral atingiu > 1.1 × 108 IU/ml. Além disso, um aumento no nível de ALT (20× UNL) denotou inflamação hepática. Durante as 48 semanas seguintes, a replicação viral diminuiu ligeiramente para 6.1 × 106 IU/ml mas recuperou primeiro para 3.6 × 107 IU/ml e depois para > 1.1 × 108 IU/ml. Mais recentemente (segundo semestre de 2010), os níveis de DNA do HBV flutuaram entre 4.3 × 104 IU/ml e 4.9 × 107 IU/ml. No final do estudo, pudemos medir a concentração de tenofovir no plasma por cromatografia líquida de alta performance em três amostras consecutivas 20 horas após a administração, atingindo 71.6 ng/ml ± 47.6 (média ± SD). Os níveis ALT-AST permaneceram ligeiramente elevados (2× UNL) durante os últimos dois anos de acompanhamento. Os isolados de HBV do paciente foram atribuídos ao genótipo A2 com base na relação filogenética entre as sequências genômicas parciais de HBV dos genes pol e preC-C. Uma análise genotípica longitudinal adicional, incluindo a composição de quasispecies das cepas de HBV isoladas do paciente, revelou a presença de mutações de resistência com base nas sequências genômicas do gene pol (Tabela). No início do tratamento com lamivudina, o HBV era de tipo selvagem em todos os clones. Após 2 anos de tal terapia, esta população viral foi completamente substituída pela mutação rtM204I - que exibe homogeneamente a resistência à lamivudina. Quando tal terapia foi interrompida por 6 meses, a composição de quasispecies consistia quase exclusivamente em sequências de nucleotídeos pol selvagens, exceto por uma contribuição menor (< 10%) que exibia a mutação associada à resistência ao adefovir I233V. Assim que o tratamento com lamivudina foi reintroduzido, e até que o entecavir mais tenofovir foram administrados, as mutações associadas à resistência à lamivudina rtL180M e rtM204I foram invariavelmente detectadas. Sob o último esquema terapêutico, apenas ephemerally e com uma contribuição menor (~5%), as mutações associadas à resistência ao adefovir e tenofovir, A181T e T184L, foram detectadas, respectivamente. Além disso, outras duas variações foram detectadas no domínio catalítico da transcriptase reversa no momento da resistência à lamivudina. Essas variantes rtA200V e rtI253V permaneceram presentes durante a terapia com entecavir, e também foram detectadas em amostras sequenciadas após a quebra durante a terapia com entecavir. A caracterização genómica do HBV ao nível preC-C mostrou a presença da dupla mutação A1762T e G1764A que foi detetada precocemente quando o paciente não estava a ser tratado, permanecendo nesta condição durante todo o período de acompanhamento. A mutação T1753C também foi consistentemente detetada. A presença destas mutações do promotor central está também relacionada com o perfil concorrente HBeAg-antiHBe acima mencionado encontrado neste paciente, como foi recentemente reportado [].