De patiënte is een meisje van nu 11 jaar, geboren drie weken te vroeg door keizersnede wegens transversale ligging, geboortegewicht 2720 g. Er waren geen voedingsproblemen in de kindertijd of later. Motorische en taalontwikkeling waren vertraagd: ze liep zonder steun op 2½-jarige leeftijd en op 3-jarige leeftijd zei ze haar eerste woorden. Op 10-jarige leeftijd kende ze het alfabet en probeerde ze letters samen te voegen. Ze gebruikte luiers tot 8-9-jarige leeftijd. Haar slaappatroon is licht onregelmatig met veel wakker worden. Congenitale misvormingen of epilepsie werden nooit ontdekt. Ze heeft een normale lengte met een lengte langs de 25e-50e percentiel en een gewicht langs het 25e percentiel, maar haar hoofdomtrek lag in het lagere normale bereik (2,5e-5e percentiel). Haar gelaatstrekken zijn ook normaal - ze is niet duidelijk dysmorf. Gedrag is normaal zonder autistische trekjes, maar bruxisme is een probleem. Ze geeft de voorkeur aan het gezelschap van jongere kinderen. Haar intellectuele niveau wordt beoordeeld als vergelijkbaar met milde tot matige ID, formele IQ-testen zijn nog niet uitgevoerd. Op 9-jarige leeftijd werd trio whole exome sequencing (WES), waarbij het DNA van het kind werd vergeleken met dat van de ouders, uitgevoerd. Hierbij werd een de novo NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G variant ontdekt die later werd bevestigd door Sanger-sequencing. In lijn met andere NAA10 missense varianten, beïnvloedt de V111G substitutie een sterk geconserveerde aminozuur. NAA10 is een 235 aminozuur eiwit dat de kenmerkende GNAT vouw gemeen heeft met NAT katalytische subeenheden. Deze vouw bestaat uit zes of zeven β-strengen en vier α-helices. β-strengen 2-5 vormen de kern van het eiwit. Deze vier β-strengen, samen met de α2-helix en de β6-β7-lus die belangrijk is voor de binding van het substraat, zijn sterk geconserveerd. V111 is gelegen aan het einde van de β5-streng, en een valine in deze positie is sterk geconserveerd in NAA10 homologen evenals in verschillende andere NAT katalytische subeenheden waarvoor kristalstructuren zijn opgelost, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) en 4LX9 (ssNAT)) [–]. De zijketen van V111 vormt een hydrofobe zak samen met Y145, M147, L119 en L109. Het is ook in de nabijheid (3.7 Å) van de zwavelgroep van Acetyl-CoA (AcCoA), wat een rol voor V111 kan aangeven in de positionering van AcCoA. Een glycine in deze positie zal geen sterische botsingen veroorzaken, maar verlies van de meer omvangrijke hydrofobe zijketen van valine kan mogelijk structurele veranderingen veroorzaken die de eiwitstabiliteit of AcCoA-binding beïnvloeden. Om de functionele beoordeling van NAA10-V111G uit te voeren, hebben we eerst His/MBP-NAA10-WT en His/MBP-NAA10-V111G in E. coli uitgedrukt, gezuiverd en de in vitro NAT-activiteit getest. In tegenstelling tot His/MBP-NAA10-WT was het moeilijk om een goede eiwit-expressie van His/MBP-NAA10-V111G te verkrijgen en een aanzienlijke fractie van de gezuiverde His/MBP-NAA10-V111G moleculen werd in het lege volume van de grootte-exclusie chromatografie kolom geëlueerd. Dit geeft aan dat delen van het eiwitaggregaat in eenheden groter dan 200 kDa, waarschijnlijk door een verandering van de eiwitstructuur of een verminderde eiwitstabiliteit. Enzymen die geëlueerd werden in een kolomvolume dat overeenkomt met monomeer His/MBP-NAA10-V111G werden getest op katalytische activiteit en vertoonden een ongeveer 85% vermindering van de katalytische activiteit in vergelijking met His/MBP-NAA10-WT. Vanwege de lage expressie en eiwitopbrengst van NAA10-V111G van E. coli transfectie en eiwitzuivering, transfecteerden we HeLa-cellen met plasmiden die gecodeerd waren voor V5-gelabeld NAA10-WT of V5-gelabeld NAA10-V111G gevolgd door immunoprecipitatie (IP) van het overexpressie-eiwit door een anti-V5 antilichaam. Daarna werd de NAT-activiteit in het neerslagmiddel gemeten. NAA10 en NAA15 vormen een eiwitcomplex met hoge affiniteit, en zoals verwacht werd endogeen NAA15 samen met beide overexpressie-eiwitten NAA10-WT-V5 en NAA10-V111G-V5 geco-immunoprecipiteerd. De hoeveelheid NAA10 en NAA15 in elk monster werd bepaald door SDS-PAGE en Western blotting. De banden van de Western blotting werden gekwantificeerd, en de gemeten katalytische activiteit werd gecorreleerd met de hoeveelheid NAA10-V5 in het monster (i.e. een mengsel van monomeer NAA10 en NAA10 in complex met NAA15 – het NatA complex), en afzonderlijk gecorreleerd met de hoeveelheid NAA15 in het monster (i.e. de hoeveelheid van het NatA complex alleen). De resultaten van het IP-activiteit experiment waren goed in overeenstemming met onze eerdere bevindingen: het vermogen van NAA10-V111G om het zure N-terminus EEEI24 te acetyleren was sterk verminderd. Het onthulde echter ook een tweede interessant kenmerk: zoals te zien is op de Western blotting in Fig., werd meer NAA15 geco-immunoprecipiteerd met NAA10-V111G-V5 in vergelijking met NAA10-WT-V5. Dit werd ook weerspiegeld in onze NAT-activiteitsmetingen, waarbij de geïmmunoprecipiteerde NAA10-V111G-V5-monster een hogere NatA productvorming (voor het NatA substracte polypeptide SESS24) vertoonde in vergelijking met het geïmmunoprecipiteerde NAA10-WT-V5-monster, wanneer gecorreleerd met de hoeveelheid totale NAA10-V5 in het monster. Wanneer gecorreleerd met de hoeveelheid NAA15 in elk monster, was de NatA productvorming per NAA15 molecuul (en dus NatA complex) echter ongeveer gelijk. Aangezien monomeer NAA10 een 1000-voudig lagere NAT-activiteit heeft ten opzichte van het NatA complex [], was de bijdrage van monomeer NAA10 aan de acetylatie van SESS24 minimaal. Alles bij elkaar genomen suggereert dit dat NAA10-V111G een verminderde katalytische activiteit heeft in een monomeer vorm, maar niet in complex met NAA15. Om de eiwitvernieuwing van NAA10-WT en NAA10-V111G te beoordelen, hebben we V5-gelabelde NAA10-WT en NAA10-V111G uitgedrukt in HeLa-cellen en cycloheximide-chase experimenten uitgevoerd. Zoals te zien is in Fig. heeft NAA10-V111G-V5 een hogere vernieuwingsgraad dan NAA10-WT-V5. 2 uur na cycloheximide behandeling was de gemiddelde hoeveelheid NAA10-V111G-V5 met ongeveer 80% verminderd, terwijl de hoeveelheid NAA10-WT-V5 met 20% verminderd was ten opzichte van de hoeveelheid NAA10-moleculen voor de cycloheximide behandeling. Hoewel de hoeveelheid NAA10-V111G-V5 drastisch afneemt na 2 uur, lijkt het niveau van NAA10-V111G-V5 te stabiliseren op ongeveer 20%. De meest waarschijnlijke overexpressie van NAA10-V111G-V5 is aanwezig in zowel een instabiele monomere vorm die snel afgebroken wordt als in complex met NAA15, dat het enzym stabiliseert en het tegen afbraak beschermt.