Een 4-jarige Eurasische ottermannetje geboren in 2015 in het 'Sendaviva, Natural Park of Navarra' (42°11′31″N, 1°09′54”O) (Noord-Oost-Spanje) werd in 2017 overgedragen aan het wildlife park 'Terra Natura' (Zuid-Oost-Spanje) De aanwezigheid van anti-Leishmania IgG2 antilichamen werd beoordeeld in het serum van de otter door een time-resolved immunofluorometrische assay (TR-IFMA) uitgevoerd zoals beschreven door Cantos-Barreda et al. []. Om te testen of de TR-IFMA assay gevalideerd voor hondenserum kan worden toegepast op ottersera, werd een Western blot analyse uitgevoerd. De Western blot werd uitgevoerd in sera van de otter met leishmaniosecompatibele symptomen, en van een hond die positief was voor Leishmania door TR-IFMA. De sera (1:2000 verdunning) werden gescheiden onder reducerende omstandigheden op mini polyacrylamide gels (0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS), 12% resolutiegels, en 4% stapelaargel). De opgeloste eiwitten werden door middel van elektroforese overgedragen op een nitrocellulose blad (Bio-Rad, USA) en geplaatst in een ROTI®Lumin substraat (Carl Roth, Duitsland) om gedurende 2 uur op kamertemperatuur te blokkeren. Schapenpolyclonaal antilichaam anti-honden IgG2 (AHP498; Bio-Rad, USA) werd gebruikt als het primaire antilichaam, terwijl konijn anti-schapen IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugat (SAB3700702; Sigma-Aldrich, USA) werd gebruikt als het secundaire antilichaam om het gebonden primaire antilichaam te detecteren. Signaaldetectie werd uitgevoerd met behulp van een Pierce ECL2 kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA) en werd gedigitaliseerd in de Typhoon 9410 scanner (GE Healthcare, USA). Een band van ongeveer 150 kDa werd waargenomen in het ottermonster evenals in het hondenmonster (zie Fig. en Aanvullende bestand). Deze bevindingen bevestigden dat de TR-IFMA assay met behulp van schapen anti-honden IgG2 in staat was om de IgG2 van de otter te detecteren. De TR-IFMA assay bestond uit een niet-competitieve indirecte methode op basis van biotinylated K39 recombinant antigen als een capture reagens, en anti-honden IgG2 polyclonaal antilichaam (Schapen anti-honden IgG2, Bio-Rad, USA) Eu3 +-gelabeld als een detector. De test omvatte serum van een zieke Leishmania-seropositieve hond als een positieve controle, en serum van een gezonde Leishmania-seronegatieve hond als een negatieve controle. De analyse werd uitgevoerd in een multi-label teller (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). De resultaten werden uitgedrukt als eenheden van fluorometrie voor Leishmania (UFL). De cut-off werd ingesteld op 22 UFL. Ook werd een enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Spanje) uitgevoerd om specifieke IgG anti-Leishmania antilichamen te detecteren, volgens de instructies van de fabrikant. Serummonsters werden verdund 1:20 en de resultaten werden uitgedrukt als een S/P (serum/positief) ratio, berekend op basis van de optische dichtheid (OD) van het serum/OD van de lage positieve controle. Een S/P ratio van meer dan 1.1 werd als positief beschouwd. De aanwezigheid van DNA van Leishmania spp. in volbloed en beenmerg werd beoordeeld door amplificatie van de kinetoplast DNA-sequentie van Leishmania spp. met behulp van een rtPCR met primers en probes die eerder werden beschreven []. Beenmerg werd afgenomen door middel van een fijne naaldaspiratie van de costochondrale unie en afgevoerd in een 1 ml buis gecoat met EDTA. DNA werd geëxtraheerd met behulp van de High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Duitsland), volgens de instructies van de fabrikant. De rtPCR werd uitgevoerd in het QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.). De interne controle TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, U.S.A.) werd inbegrepen. De rtPCR werd uitgevoerd in een eindvolume van 20 μL, inclusief 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, U.S.A.), 900 nM van elke primer, 200 nM van TaqMan probe, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA, en 50 ng DNA van elke sample. De cycling parameters waren: 50 °C gedurende 30 s, 95 °C gedurende 10 min, 45 cycli bij 94 °C gedurende 30 s, en 55 °C gedurende 1 min. Elke amplificatie run bevatte positieve en negatieve controles, en elke meting werd uitgevoerd in drievoud. Voor de identificatie van de Leishmania species werd de PCR producten van de positieve samples gezuiverd met behulp van de High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Duitsland) en ingediend voor sequentiebepaling bij de Sectie Moleculaire Biologie van de Universiteit van Murcia. De verkregen sequenties werden vergeleken met die beschikbaar in GenBank. Als negatieve controle werden dezelfde analyses uitgevoerd op een 3-jarige Euraziatische otter uit hetzelfde wildpark zonder klinische symptomen die compatibel waren met leishmaniasis. Alle resultaten verschijnen in tabel. Het voorkomen van leishmaniasis werd bevestigd en specifieke behandeling werd toegediend (allopurinol 15 mg/kg/24 u/p.o.). De behandeling werd gevolgd in november 2019, na 3 maanden behandeling. Bilaterale nefropathie met hydronephrosis, mesenterische lymfadenomegaly en ascites werden waargenomen. Het CBC toonde een afname van witte bloedcellen en een afname van bloedplaatjes in de Leishmania-positieve otter. Het biochemisch profiel van het serum van de Leishmania-positieve otter toonde hyperproteïnemie, hyperglobulinemie, afname van PON-1 en toename van haptoglobine en ferritine. De urinalyse toonde proteïnurie en afname van de osmolariteit en het specifieke gewicht. De aanwezigheid van anti-Leishmania IgG2 antilichamen en een positief resultaat door RT-PCR in termen van volbloed en beenmerg werd waargenomen bij de Leishmania-positieve otter. De sequentie van positieve monsters bevestigde de identificatie van L. infantum. De versterkte sequentie vertoonde 100% gelijkenis met een L. infantum referentiesequentie. Daarnaast werden ovale micro-organismen met een excentrische kern die compatibel was met Leishmania spp. amastigotes waargenomen in de cytologie van de milt (Fig.