Een 52-jarige vrouw met een voorgeschiedenis van cholecystectomie en gedeeltelijke resectie van de linker leverlob in 2004 als gevolg van symptomatische galstenen en meerdere intrahepatische galwegcholelithiasis had intermitterende koorts en progressieve geelzucht vanaf begin november 2014. Galwegobstructie en een vermoedelijke leverhepatische hyperplasie werden ontdekt door daaropvolgende ultrasound, MRI, MRI en PET-CT:). Een exploratieve laparotomie werd uitgevoerd eind november 2014 (Addendum: Figuur S1) en er werd een ernstige intra-abdominale adhesie, een knobbel (1 × 2 cm) met verharde textuur in de proximale linker leverbuis en verspreide neoplastische laesies die de leverader, het hepatoduodenale ligament, de omliggende lymfeklieren, de leverader, de poortader en de coeliakus as infiltreerden, gevonden. Deze bevindingen dwongen de chirurgen om een radicale resectie op te geven. Purulent gal werd uit de gemeenschappelijke buis geloosd en een slijmprop stak uit de wand van de galweg. Gedeeltelijke neoplastische laesies werden verwijderd uit de vergrote lymfeklieren, de kern van de linker leverbuis en de marge van de gemeenschappelijke leverader voor pathologisch onderzoek. Een galwegdrainage werd geïnstalleerd om de galwegobstructie te verlichten. Pathologische verslagen onthulden dat de aard van de tumor slecht gedifferentieerd adenocarcinoom was met differentiatiemerken van cholangiecyt; bovendien werd een matige EGFR-expressie gevonden in >90% van de tumorcellen. Deze patiënte werd uiteindelijk gediagnosticeerd als gevorderde niet-operabele perihilar CCA. Vijf weken na palliatieve chirurgie ontving de patiënte een 4-weekse kuur van TOMO-therapie op de hypermetabolische laesie van de lever (DT = 60 Gy/25 F), een cyclus van systematische chemotherapie met albumine-gebonden paclitaxel alleen voor haar ondraaglijke gastrointestinale toxiciteiten en de infusie van autologe cytokine-geïnduceerde killercellen. Vanwege de progressieve toename van CA199 werd PET-CT onmiddellijk na de voltooiing van de radiotherapie opnieuw onderzocht en vertoonde een nieuwe hypermetabolische laesie in de levercauda en vergrote zachte weefsels en retroperitoneale lymfeknopen met abnormale standaardwaarde (SUV) tussen de lever en de maag in vergelijking met de PET-CT voorafgaand aan de radiotherapie:). Vier weken na de radiotherapie werd de patiënte ingeschreven in de CART-EGFR-studie. Haar prestatiestatus was 1 volgens de criteria van de Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Tijdens de voorbereiding van CART-EGFR-cellen ontwikkelde ze hoge koorts, agressieve geelzucht en obstructie van de galweg, vergezeld van de continue verhoging van CA199 (van 100,5 tot 413,5 U/ml), agressieve toename van totaal bilirubine, direct bilirubine en andere galwegobstructie-gerelateerde enzymologische indexen en werd behandeld met effectieve breedspectrumantibiotica en endoscopische stentplaatsing in de levergalen. De studies (ClinicalTrials.gov identifier NCT01869166, NCT02541370) werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Chinese PLA General Hospital. Er was geen commerciële sponsor betrokken bij de studies. De ingeschreven patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming volgens de Verklaring van Helsinki. De DNA-sequentie van het enkelstrengs variabele fragment (scFv) dat zich richt op het EGFR-antigeen werd afgeleid van JQ306330.1 (GenBank Number). Anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta CAR werd gegenereerd en gekloond in de pWPT lentivirale ruggengraat, die in detail werd beschreven door Feng et al. []. De constructie werd geverifieerd door DNA-sequentiebepaling. Een pseudotyped, klinisch-grade lentivirale vector supernatant werd geproduceerd door standaard transiënte transfectie zoals beschreven door McGinley et al. [ ] Volgens de instructies van de fabrikant van Lipofectamine 3000 transfectie reagens (Invitrogen, USA), werd pWPT-anti-EGFR CAR plasmide, ps-PAX2 verpakkingsplasmide, en pMD2.G envelopplasmide transfecteerd in 293 T cellen. De lentivirale supernatanten werden verzameld en opgeslagen bij -80 °C. De GFP-CD137-CD3zeta vector werd geconstrueerd om de transductie efficiëntie te verifiëren door middel van FACSCalibur flow cytometrie (BD Biosciences). De DNA-sequentie van scFv gericht op CD133 antigeen werd afgeleid van HW350341.1 (GenBank Number), de generatie, constructie en het testen van CART-EGFR cellen volgde dezelfde procedure als bij CART-EGFR cellen (Additionele bestand: Figuur S2). CART-cellen werden vervaardigd uit autologe perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) verzameld in celbereidingstangen (BD Biosciences, San Jose, CA) gezuiverd uit 80 tot 100 ml volbloed in de Good Manufacturing Practice Facility van het Chinese PLA General Hospital volgens de huidige standaardprocedures. PBMC's werden gestimuleerd met 50 ng/ml anti-CD3 MoAb (Takara, Japan) en 500 U/ml recombinant humaan interleukine-2 (Peprotech, USA) in GT-T551 medium (Takara). Lentivirale transductie werd uitgevoerd in GT-T551 medium met protamine sulfaat (Sigma) gedurende 24 uur na 2 dagen van T-celcultuur. Daarna werden de cellen verder uitgebreid in cultuurzakken (Takara) en geoogst als CART-cellen. Bacteriën, schimmels en endotoxine werden getest vóór de infusie van CART-cellen. De immunofenotype van CART-cellen werd geanalyseerd door middel van flowcytometrie met fluorescent gelabelde antilichamen specifiek voor de kleuring van CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L en CCR7. Voor de controle van de kleuring werden isotype-gematchte monoklonale antilichamen (BD Biosciences) gebruikt. De CAR-expressie werd geschat op basis van GFP-CD137-CD3zeta-getransduceerde cellen in dezelfde batch voor alle patiënten door middel van flowcytometrie. De gegevensverzameling en -analyse werd uitgevoerd met behulp van een FACSCalibur flowcytometrie (BD Biosciences). De in vitro cytotoxiciteit van CART-EGFR-cellen werd getest door middel van co-cultuur met EGFR-positieve tumorcellen bij verschillende effector-tot-doelverhoudingen in 96-well platen met behulp van een 4-uurs CCK-8 Detection kit (DOJINDO, Japan). Q-PCR werd gebruikt om het niveau van CAR fusie-gen te beoordelen volgens een eerder beschreven protocol.13 Een 153-bp (basispaar) fragment dat delen van de CD8a keten en aangrenzende 4-1BB keten bevat (de voorwaartse primer 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ en reverse primer 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) werd versterkt door het ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Beta-actine werd gebruikt als een interne controle. Een 7-punts standaardcurve die bestond uit 100 tot 108 kopieën/μl plasmid DNA dat het CAR gen bevatte werd voorbereid. Serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF en Granzyme B werden getest met behulp van een BD Biosciences microbead sandwich immunoassay volgens de instructies van de fabrikant. Volgens het kweek systeem zoals eerder gerapporteerd [], werden CART-EGFR cellen gegenereerd uit de mononucleaire cellen van 80-100 ml van het perifere bloed van de patiënt en vrijgegeven voor de infusies. Van de infuseerde cellen tijdens de eerste cyclus van CART-EGFR therapie was 99.14% CD3+ cellen voornamelijk samengesteld uit de CD8+ subset (62.26%), en 23.61% werd gekenmerkt met de centrale geheugen fenotype (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Daarnaast was 8.99% van de infuseerde cellen EGFR positief. De fenotype en transfectie efficiëntie van infuseerde CART-EGFR cellen in elke cyclus zijn gedocumenteerd in tabel. CART133 cellen werden gegenereerd en gekweekt volgens dezelfde procedure als CART-EGFR cellen. Van de geïnfuseerde cellen was 95,2% CD3+ cellen voornamelijk samengesteld uit de CD8+ subset (71,9%), en 41,9% was CD45RO+/CD62L+/CCR7+ subset. Daarnaast was 6,4% van de geïnfuseerde cellen CD133 positief. Details zijn gedocumenteerd in tabel. Vanwege de onlangs voltooide radiotherapie binnen 2 maanden en intolerantie van chemotherapeutische middelen kreeg de patiënt 4 opeenvolgende infusies van 2,2 × 106/kg CART-EGFR-cellen in totaal toegediend zonder enige conditioneringstherapie, en bereikte een PR in haar eerste beoordeling 6 weken later, beoordeeld volgens Response Evaluation Criteria in Solid Tumors versie 1.1 (RECIST 1.1) met zowel MRI als PET-CT, die een krimp van meer dan 80% van de metastatische laesies in de leverhilus en caudale lob illustreren en een opmerkelijke daling van de SUV, samen met een snelle daling van CA199 van 413,5 tot 123,1 U/ml. Het aantal kopieën van het CAR-transgene in het perifere bloed van de patiënt bereikte een piek van 5916 pg/dl op dag 9 vergezeld met afgifte van cytokines zoals interleukine-6 (IL-6) en C reactief eiwit (CRP). De tweede cyclus van CART-EGFR monotherapie werd toegediend met een dosis EGFR-CAR+ expressie T-cellen 2,1 × 106/kg en zonder enige pre-conditioning behandeling omdat het aantal kopieën van het CAR-transgene in het perifere bloed daalde tot bijna het basisniveau 2 maanden na de eerste infusie van CAR-EGFR expressie genetisch gemodificeerde T-cellen. Routineonderzoeken van MRI en PET-CT toonden een aanhoudende PR aan vergezeld met een verdere daling van CA199 tot 61,2 U/ml. Interessant is dat het piek aantal kopieën van het CAR-transgene na de tweede cyclus infusie van CART-EGFR cellen niet een parallelle of hogere piek bereikte als de eerste cyclus van CART-EGFR therapie. De PR status van de patiënt werd gedurende 8,5 maanden gehandhaafd tot ze frequent onbeheersbaar braken, pijn in de bovenbuik en maagzuurreflux ontwikkelde, die midden november 2015 optraden. De daaropvolgende elektronische gastroscopie toonde een vernauwing van de duodenumbolus en PET-CT bevestigde tumorprogressie met illustratie van meerdere nieuwe SUV abnormale laesies in het omentum majus, peritoneum en buikholte. Vervolgens werd de patiënt behandeld met 1 cyclus van CART-EGFR-therapie gecombineerd met 2 cycli van anti-geprogrammeerde celdood eiwit 1 (PD-1) monoklonale antilichaam (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), die werd toegediend in een dosis van 100 mg elke 2 weken. Evenzo bereikte het aantal CAR transgene kopieën gemonitord in het perifere bloed niet een vergelijkbare piekniveau van de eerste cyclus infusie zelfs gecombineerd met anti-PD-1 antilichaam. Ondanks het serum CA199 dat tijdelijk afnam van 326.3 tot 210.8 U/ml, detecteerde de volgende PET-CT nieuw opkomende metastasen in de onderkant van het bekken, rechter leverlob en linker supraclaviculaire lymfeknoop evenals vergroting van eerdere tumorlaesies in de buik in vergelijking met de PET-CT voor de gecombineerde immunotherapie. Omdat meer dan 90% van de tumorcellen CD133-eiwitten uitten (Aanvullende bestand: Figuur S3), werd de patiënte vervolgens ingeschreven in de CART133-studie en kreeg ze de infusie van 1,22 × 106/kg CD133-specifieke CART-cellen zonder conditioneringsbehandeling. Omdat de obstructie van de afdalende twaalfvingerige darm en de daaruit voortvloeiende aanhoudende ernstige infectie van de galwegen en het leverabces, die het niveau van serum CA199 kunnen beïnvloeden en met antibiotica werden behandeld, werd de geplande beeldvormingsevaluatie uitgesteld tot 2 maanden na de infusie van CART133-cellen, waarbij de contrastversterkte CT opmerkelijke krimp of zelfs verdwijning van sommige metastasen in het peritoneum en de buikholte liet zien, wat leidde tot een evaluatie van PR en bloedkweek zien, die de diagnose van infectie niet ondersteunden, maar die ondertussen een escalatie van IL-6 en CRP en een acute toename van glutaminezuur-pyruvaat transaminase en glutaminezuur-oxalaat transaminase (>6ULN) lieten zien. Er verschenen een paar verspreide kleine huiduitslagen op de linker dij 2 weken na de eerste cyclusinfusie van CART-EGFR cellen, die geleidelijk erger werden en duidelijk zichtbaar en jeukend werden met de presentatie van meerdere schilferige of lineaire huiduitslagen die zich van de linker dij naar de kuit verspreidden en samenvloeiden, die werd ingedeeld als 2 volgens de gemeenschappelijke terminologische criteria voor bijwerkingen 4.0 (CTCAE 4.0), toen de tweede cyclus van CART immunotherapie werd voltooid. De huiduitslagen werden biopsieerd met illustratie van lichen striatus-achtige pathologische veranderingen zoals het verlies van een deel van de epidermis, vacuolaire degeneratie van basale cellen en infiltratie van talrijke T-lymfocyten in de epidermis en haar aanhangsels, en werden met succes beheerd met tacrolimus zalf. Tijdens de CART-EGFR behandeling trad geen hypotensie op. Opgelet met milde misselijkheid, braken, koude rillingen, koorts en vermoeidheid, er waren geen andere acute bijwerkingen tijdens de combinatiebehandeling. Hoewel roos verscheen en verergerde na de gecombineerde immunotherapie, was er geen medische interventie nodig. Serumspiegels van cytokines zoals tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-6 en CRP stegen lichtjes en veroorzaakten geen symptomen van cytokine release. Tijdens de infusie van opeenvolgende dosisverhogende CART133-cellen over 4 dagen waren er geen andere bijwerkingen behalve milde koorts en vermoeidheid gerelateerd aan de infusie. Op de tweede ochtend na de voltooiing van de infusie van CART133-cellen, ontwikkelde deze patiënte echter intermitterende, doffe pijn in de bovenbuik, koude rillingen, koorts (39,1 °C), sporadische, zeer kleine bloedingen en congestieve huiduitslag op haar kuiten, die zich snel en wijdverspreid uitbreidden naar haar nek, rechter bovenarm, borst, linkerbuik en achterkant van de keel, vergezeld van jeuk en diarree in de namiddag en die in de volgende 10 dagen verder verslechterden en de programma-death-ligand 1 (PD-L1) [,], wat resulteert in een snel verlies van hun cytolytische en cytokinesecretievermogen en een toestand van hyporesponsiviteit [] Inkomen. Bovendien vertonen solide tumoren vaak metabolische afwijkingen door een overconsumptie van belangrijke aminozuren die cruciaal zijn voor de activiteit van T-cellen en induceren hypoxie en een resulterende verzuring van de extracellulaire matrix door onvoldoende vasculaire toevoer die vijandig is voor de overleving van T-cellen [] Zo is modulatie van de micro-omgeving van de tumor nodig om de uitkomsten te verbeteren. In dit geval werd de patiënte, ondanks het feit dat ze geen directe conditionerende behandeling kreeg met als doel de micro-omgeving van de tumor te transformeren, behandeld met 60 Gy radiotherapie voorafgaand aan de immunotherapie met een interval van ongeveer 1 maand tussen het einde van de radiotherapie en het begin van de infusie van CART-cellen. Hoewel de radiotherapie zelf niet effectief was om tumorcellen uit te roeien, kan het directe en vertraagde effect ervan een rol spelen in de vernietiging van het stroma dat de tumor ondersteunt, de biologie van de micro-omgeving van de tumor verandert, de afgifte van meer tumorgebonden antigenen bevordert en de immuunherkenning versterkt [] Bovendien kan radiotherapie tumoren meer immunogeen en vatbaarder maken voor een verbeterde aanval door de immuuncellen [], en zelfs antitumoreffecten genereren in die afgelegen metastasen die niet lokaal bestraald waren (de zogenaamde abscopale effect) [, ]. Hiertoe hebben we de hypothese geformuleerd dat radiotherapie een redelijke en effectieve conditionerende therapie kan zijn om de uitkomsten van CART-therapie te verbeteren. Toen de resistentie tegen CART-EGFR-therapie werd bevestigd, probeerden we een keer een combinatie-immunotherapie met anti-PD-1-antilichaam in combinatie met CART-EGFR-celinfusie op basis van een preklinische studie dat de blokkade van PD-1-immunosuppressie de therapeutische werkzaamheid van CART-celtherapie tegen vaste tumoren aanzienlijk zou kunnen verbeteren []. Helaas eindigde deze behandeling in een mislukking met PET-CT dat de progressie van de ziekte verifieerde, hoewel CA199 tijdelijk afnam. Een mogelijke verklaring is het onduidelijke niveau van PD-L1-expressie. Onlangs wordt PD-L1-expressie benadrukt voor de waarde ervan bij het voorspellen van de therapeutische effecten van anti-PD-1-geneesmiddelen. De tumorlaesie was echter moeilijk te biopsieeren door de anatomische locatie, waardoor het niveau van de PD-L1-eiwit-expressie op tumorcellen niet nauwkeurig kon worden gedetecteerd vóór de aanvang van de anti-PD-1-therapie, wat de mogelijkheid dat de PD-L1-expressie in het tumormilieu laag of zelfs negatief was en daarom tot het falen van de anti-PD-1-behandeling zou kunnen leiden. Ondertussen waren er veel andere parallelle checkpoint-routes die mogelijk weerstand tegen anti-PD-1-therapie konden ondersteunen []. Onder deze situatie was het selecteren van een rationeel doel cruciaal voor de volgende stap van de behandeling van de patiënten. Onlangs heeft de CSC's in CCA grote aandacht getrokken voor hun zeer carcinogene eigenschappen en sleutelrollen bij het bemiddelen van zelfvernieuwing, hergroei van tumoren en therapeutische weerstand, waardoor therapie die gericht was op oppervlakte moleculaire markers en signaleringsroutes specifiek voor CSC's een mogelijke krachtige optie voor CCA zou zijn [, ]. Onder de moleculen die individueel of in combinatie werden gebruikt om cholangiocarcinoma stamcellen te identificeren, is CD133 een van de belangrijkste stamcelmarkers die geassocieerd zijn met hogere invasiviteit en slechtere prognose []. Shien en collega's rapporteerden ook dat CD133-positieve tumorcellen een grotere weerstand vertoonden tegen postoperatieve behandeling dan CD133 negatieve cellen, en een verhoogde CD133 expressie werd waargenomen in residuele kankercellen na adjuvante therapie []. Op basis van het bovenstaande hebben we uiteindelijk CD133 geselecteerd als het doelantigeen voor CART-immunotherapie, wat op zijn beurt een nieuwe gedeeltelijke respons opleverde, en verder aangetoond dat CART cocktail-immunotherapie haalbaar en rationeel is. Een ander cruciaal probleem was de toxiciteit, die veroorzaakt kan worden door CART-EGFR-cellen op de doelantigenen die op tumorcellen en/of synchroon op normale weefsels tot uitdrukking komen, ook wel het on-target off-tumor effect genoemd. Schade aan normaal weefsel kan zelfs optreden door onverwachte kruisreactie met een eiwit dat niet op tumorcellen tot uitdrukking komt []. Sinds de start van de CART-EGFR-celleninfusie heeft deze patiënt niet alleen koorts, koude rillingen en vermoeidheid als gevolg van de infusie, maar ook aanhoudende pyrexie, acute verhoging van serumtransaminasen en vertraagde huiduitslag, vergezeld van een sterke verhoging van het aantal CAR-transgene kopieën, IL-6 en CRP, hoewel de niveaus niet aan de criteria voor het diagnosticeren van cytokine-release syndroom voldeden [, ]. De enorme cytokines die rechtstreeks door de infuseerde CART-cellen geproduceerd kunnen worden, weerspiegelden een sterke immuunrespons die zowel antitumoreffecten op tumorcellen als bijwerkingen op normaal weefsel kan genereren. Bovendien was het on-target off-tumor effect veroorzaakt door CART-EGFR-cellen waarschijnlijk de reden voor het opwekken van huiduitslag door de verspreiding van EGFR op de epidermis []. Hoewel al deze bijwerkingen mild, reversibel en beheersbaar waren met ondersteunende zorg en topische corticosteroïden, verergerde de toevoeging van anti-PD-1-antilichaam de toxiciteiten van CART-EGFR-immunotherapie in dit geval niet. Desondanks was deze patiënt bij de daaropvolgende behandeling met CART133-celleninfusie ernstig blootgesteld aan huiduitslag, orale mucosale en gastrointestinale toxiciteiten zoals congestief huiduitslag en bloedingen. Hoewel deze toxiciteiten met opkomende medische interventies waaronder intraveneuze methylprednisolon en anti-TNF-remmer succesvol werden beheerd, kan het inherente mechanisme grotendeels te wijten zijn aan het on-target off-tumor effect van CART133-cellen die zich richten op het CD133-antigeen dat op normaal epitheel en vasculair endotheel tot uitdrukking komt. Ondertussen was het onduidelijk of het anti-PD-1-antilichaam en de resterende CART-EGFR-cellen in vivo een rol konden spelen bij het verergeren van de toxiciteiten van CART133-immunotherapie.