Een 47-jarige vrouw (gewicht: 62 kg) werd in 1996 gediagnosticeerd met chronische actieve HBeAg-positieve hepatitis B. Virale parameters zoals HBeAg, anti-HBe IgG en HBV plasma virale lading van bevroren monsters werden gelijktijdig gemeten door een unieke operator om intra- en inter-assay variaties te verminderen. HBeAg en anti-HBe werden bepaald door elektrochemiluminescentie (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). HBV virale ladingsniveaus werden bepaald door real time PCR (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, dynamisch bereik 30 IU/ml tot 110,000,000 IU/ml) []. Leverontsteking werd gemeten door serum alanine aminotransferase (ALT) niveaus. Voor sequentieanalyse werden HBV pol- en preC-core-genen sequentieel gesequenced met primers zoals eerder beschreven []. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een ABI3100-instrument (Applied Biosystems), en de sequenties die in dit werk werden geïntroduceerd evenals die verkregen uit de GenBank-database werden uitgelijnd met ClustalX v1.83 [] en bewerkt met Bioedit v7.0.9.0 [] De HBV-genotype werd beoordeeld door fylogenetische gevolgtrekking met behulp van het Neighbor-joining algoritme met het Kimura-tweeparametermodel van moleculaire evolutie in de MEGA v3.1 software [] Secvens van beide genen werden verkregen op verschillende tijdstippen tijdens antivirale therapie. Een meer gedetailleerde HBV pol gen clonaalanalyse werd uitgevoerd op zeven geselecteerde virale isolaten van serummonsters die werden geoogst tijdens opeenvolgende therapieën. Elk geselecteerd PCR product van pol gen werd gekloond in pGEM-T Easy vector volgens de instructies van de fabrikant (Promega, Wisconsin, USA) en ten minste 15 klonen werden verder geanalyseerd door sequentiëring. Hierdoor was het mogelijk om de evolutie van virale quasi-soorten te analyseren onder de opeenvolgende antivirale druk op basis van analyse van het pol gen. De anti-HBV-behandelingsinterventies vergezeld van de HBV virale lading en ALT-niveau kinetiek worden getoond in figuur. Therapie werd geïnitieerd toen de HBV virale lading steeg tot 6.5 × 106 IU/ml. In 1998 toen de patiënt werd behandeld met IFN-alpha 5 MU driemaal per week gedurende 30 weken, was het HBV DNA niveau lager dan de detectielimiet. Deze therapie werd onderbroken en vervangen in 1999 door lamivudine (150 mg eenmaal per dag). Na 2 jaar van continue behandeling was het HBV DNA detecteerbaar (15.5 × 106 IU/ml). HBeAg bleef negatief met detecteerbare anti-HBe gedurende deze periode van behandeling. In 2001, na een 6-maandse onderbreking, gaf het HBV DNA niveau een post-behandeling opflakkering aan (1 × 108 IU/ml). Aan het einde van 2003 werd de lamivudine therapie opnieuw geïntroduceerd (150 mg eenmaal per dag). Het werd vergezeld door een zeldzaam geval van terugkeer naar een HBeAg-positief/anti-HBe negatief profiel, dat gedurende twee jaar detecteerbaar bleef. De virale lading bereikte op dit moment 3.1 × 106 IU/ml. Tien maanden later, in 2006, werd het lamivudine regime vervangen door adefovir monotherapie (10 mg/dag). Aanvankelijk waren de virale ladingniveaus laag (8.5 × 104 IU/ml) maar na 48 weken therapie bereikten deze niveaus 7.15 × 106 IU/ml. ALT niveaus waren normaal tijdens dit interval. Reactivering van HBV replicatie werd aangenomen gezien de gelijktijdige detectie van HBeAg/anti-HBe [] en de hoge replicatie die werd gedetecteerd. Het samengaan van HBeAg en anti-HBe lijkt niet ongewoon te zijn onder antivirale behandeling-naïeve patiënten, maar de prevalentie bij therapie-ervaren patiënten is onbekend. Dit serologische patroon is gerelateerd aan uitgebreide hepatocytenschade en ernstige immuun-gemedieerde leverschade en de daaruit volgende disfunctie []. Zes maanden later, steeg ALT niveau lichtjes (1.5× hogere normale grens - UNL -) en entecavir monotherapie werd ingesteld (1 mg dagelijks). Na een 5-maand durende entecavir monotherapie werd tenofovir (300 mg eenmaal daags) toegevoegd aan het behandelregime voor dubbele therapie. Het HBV DNA daalde gedurende vier maanden tot 1 × 105 IU/ml, maar drie maanden later bereikte de virale lading > 1.1 × 108 IU/ml. Daarnaast wees een stijging van het ALT-niveau (20× UNL) op leverontsteking. Gedurende de volgende 48 weken daalde de virale replicatie licht tot 6.1 × 106 IU/ml, maar herstelde zich eerst tot 3.6 × 107 IU/ml en later tot > 1.1 × 108 IU/ml. Meer recentelijk (tweede semester 2010) fluctueerde het HBV DNA tussen 4.3 × 104 IU/ml en 4.9 × 107 IU/ml. Aan het einde van de studie follow-up konden we de tenofovirconcentratie in plasma meten door middel van high performance liquid chromatography in drie opeenvolgende monsters 20 uur na toediening, die 71.6 ng/ml ± 47.6 (gemiddelde ± SD) bereikten. De ALT-AST-niveaus bleven licht verhoogd (2× UNL) tijdens de laatste twee jaar van follow-up. HBV-isolaten van de patiënt werden toegeschreven aan genotype A2 op basis van fylogenetische verwantschap tussen de gedeeltelijke HBV-genomische sequenties van zowel de pol- als de preC-C-genen. Een verdere longitudinale genotypische analyse, inclusief de quasispecies-samenstelling van HBV-stammen geïsoleerd van de patiënt, onthulde de aanwezigheid van resistentiemutaties op basis van de pol-gensekvenses (Tabel). Aan het begin van de lamivudine-behandeling was HBV wild-type in alle klonen. Na 2 jaar onder dergelijke therapie werd deze virale populatie volledig vervangen door de rtM204I-homogene mutatie die lamivudine-resistentie vertoonde. Toen deze therapie gedurende 6 maanden werd onderbroken, bestond de quasispecies-samenstelling bijna uitsluitend uit wild-type pol-nucleotide sequenties, met uitzondering van een kleine bijdrage (< 10%) die de adefovir-resistentie-geassocieerde mutatie I233V vertoonde. Toen de lamivudine-therapie werd heringevoerd, en tot entecavir plus tenofovir werden toegediend, werden de dubbele lamivudine-resistentie-geassocieerde mutaties rtL180M en rtM204I onveranderlijk gedetecteerd. Onder de laatste therapeutische regeling werden alleen de ephemerale en met een kleine bijdrage (< 5%) de A181T- en T184L-lamivudine-adefovir- en entecavir-resistentie-geassocieerde mutaties gedetecteerd. Bovendien werden twee andere variaties ontdekt in het katalytische domein van reverse transcriptase op het moment van lamivudineresistentie. Deze rtA200V- en rtI253V-varianten bleven aanwezig tijdens de entecavirtherapie en werden ook ontdekt in de sequenties van de monsters na doorbraak tijdens de entecavirtherapie. De HBV genomische karakterisering op preC-C niveau toonde de aanwezigheid van de A1762T en G1764A dubbele mutatie die vroeg werd gedetecteerd toen de patiënt niet behandeld werd, en die in deze toestand bleef gedurende de hele follow-up. De T1753C mutatie werd ook consequent gedetecteerd. De aanwezigheid van deze kernpromotor mutaties zijn ook gerelateerd aan het bovengenoemde HBeAg-antiHBe concurrent profiel gevonden in deze patiënt, zoals recent gerapporteerd [].