Pasienten er en jente, nå 11 år gammel, født tre uker for tidlig ved snitt på grunn av tverrgående stilling, fødselsvekt 2720 g. Det var ingen problemer med å mate henne i barndommen eller senere. Motor- og språkutvikling var forsinket: hun gikk uten støtte i en alder av 2½ år, og i en alder av 3 år sa hun sine første ord. I en alder av 10 år kjente hun alfabetet og prøvde å sette bokstaver sammen. Hun brukte bleier til en alder av 8–9 år. Søvnen hennes er mildt uregelmessig med hyppige våkninger. Medfødte misdannelser eller epilepsi har aldri blitt oppdaget. Hun har normal høyde med lengde langs 25. til 50. percentil og vekt langs 25. percentil, men hodet hennes har vært i det nedre normale området (2.5. til 5. percentil). Ansiktsfunksjonene hennes er også normale - hun er ikke tydelig dysmorfisk. Oppførselen er normal uten autistiske trekk, men bruxisme er et problem. Hun foretrekker selskap med yngre barn. Intellektuelt nivå er vurdert å være sammenlignbart med mild-moderat ID, formell IQ testing har ikke ennå blitt gjort. I en alder av 9 år trio hele exome sekvensering (WES), som sammenlignet barnets DNA-sekvenser med foreldrenes, avslørte en de novo NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G variant som ble ytterligere bekreftet av Sanger sekvensering. I tråd med andre NAA10 missense varianter, påvirker V111G substitusjonen en svært konservert aminosyre. NAA10 er et 235 aminosyreprotein som tilpasser den karakteristiske GNAT folden som er felles for NAT katalytiske underenheter. Denne folden består av seks eller syv β-kjeder og fire α-heliks. β-kjeder 2-5 utgjør kjernen av proteinet. Disse fire β-kjedene, sammen med α2-heliks og β6-β7-løkken som er viktig for substratbinding, er svært konservert. V111 er plassert mot slutten av β5-kjeden, og en valin i denne posisjonen er svært konservert i NAA10 homologer så vel som i flere andre NAT katalytiske underenheter for hvilke krystallstrukturer har blitt løst, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) og 4LX9 (ssNAT)) [–]. Sidekjeden til V111 danner en hydrofob lomme sammen med Y145, M147, L119 og L109. Den er også i nærheten (3.7 Å) til svovelgruppen av acetyl-CoA (AcCoA), som kan indikere en rolle for V111 i posisjonering av AcCoA. En glycin i denne posisjonen vil ikke forårsake noen steriske konflikter, men tap av den mer voluminøse hydrofobe sidekjeden av valin kan muligens forårsake strukturelle endringer som påvirker proteinstyrken eller AcCoA-binding. For å kunne funksjonelt vurdere NAA10-V111G, uttrykte vi først His/MBP-NAA10-WT og His/MBP-NAA10-V111G i E. coli, renset enzymer og testet NAT-aktiviteten in vitro. I motsetning til His/MBP-NAA10-WT var det vanskelig å oppnå god proteinuttrykk av His/MBP-NAA10-V111G, og en betydelig fraksjon av de rensede His/MBP-NAA10-V111G-molekylene eluerte i tomrommet i størrelseseksklusjonskromatografikolonnen. Dette indikerer at deler av proteinet aggregerer i enheter større enn 200 kDa, mest sannsynlig på grunn av en endring i proteinstrukturen eller redusert proteinstruktur. Enzymer som eluerte ved et kolonnevolum tilsvarende monomer His/MBP-NAA10-V111G ble testet for katalytisk aktivitet og viste en omtrent 85 % reduksjon i katalytisk aktivitet sammenlignet med His/MBP-NAA10-WT. På grunn av det lave ekspresjonsnivået og proteinutbyttet av NAA10-V111G fra E. coli transfeksjon og proteinrensing, transfekterte vi HeLa-celler med plasmider som koder for enten V5-tagged NAA10-WT eller V5-tagged NAA10-V111G etterfulgt av immunpresipitering (IP) av det overeksprimerte proteinet ved hjelp av et anti-V5 antistoff. Deretter ble NAT-aktivitet i presipitatet målt. NAA10 og NAA15 danner et høyaffinitets-proteinkompleks, og som forventet ble endogent NAA15 ko-immunpresipitert med både overeksprimerte NAA10-WT-V5 og NAA10-V111G-V5. Mengden av NAA10 og NAA15 som var til stede i hver prøve ble bestemt ved SDS-PAGE og Western blotting. Bånd fra Western blottet ble kvantifisert, og den målte katalytiske aktiviteten ble korrelert med mengden av NAA10-V5 som var til stede i prøven (dvs. en blanding av monomerisk NAA10 og NAA10 i kompleks med NAA15 – NatA-komplekset), og ble separat korrelert med mengden av NAA15 som var til stede i prøven (dvs. mengden av NatA-komplekset alene). Resultatene fra IP-aktivitetseksperimentet stemte godt overens med våre tidligere funn: NAA10-V111Gs evne til å acetylere den sure N-terminalen EEEI24 ble sterkt redusert. Det avslørte imidlertid også et annet interessant trekk: Som det kan ses fra Western blottet i Fig., ble mer NAA15 ko-immunpresipitert med NAA10-V111G-V5 sammenlignet med NAA10-WT-V5. Dette ble også reflektert i våre NAT-aktivitetsmålinger hvor det immunpresipiterte NAA10-V111G-V5-prøven viste høyere NatA-produktdannelse (for NatA-substratpolypeptidet SESS24) sammenlignet med den immunpresipiterte NAA10-WT-V5-prøven når det ble korrelert med mengden av totalt NAA10-V5 som var til stede i prøven. Når det ble korrelert med mengden av NAA15 som var til stede i hver prøve, var imidlertid NatA-produktdannelsen per NAA15-molekyl (og dermed NatA-komplekset) omtrent lik. Da monomerisk NAA10 har en 1000 ganger lavere NAT-aktivitet mot NatA-substrater sammenlignet med NatA-komplekset [], var bidraget fra monomerisk NAA10 på acetylering av SESS24 minimal. Alt i alt antyder dette at NAA10-V111G har redusert katalytisk aktivitet i en monomer form, men ikke i kompleks med NAA15. For å vurdere proteinomslaget av NAA10-WT og NAA10-V111G, uttrykte vi V5-tagged NAA10-WT og NAA10-V111G i HeLa-celler og utførte sykloseksimid-chase-eksperimenter. Som det kan sees fra figur 1, har NAA10-V111G-V5 en høyere omsatt rate enn NAA10-WT-V5. 2 timer etter sykloseksimid-behandling ble den gjennomsnittlige mengden av NAA10-V111G-V5 redusert med omtrent 80 %, mens NAA10-WT-V5-molekylene ble redusert med 20 % i forhold til mengden av NAA10-molekyler før sykloseksimid-behandling. Selv om mengden av NAA10-V111G-V5 er drastisk redusert etter 2 timer, ser nivået av NAA10-V111G-V5 ut til å stabilisere seg på rundt 20 %. Mest sannsynlig er overekspresjon av NAA10-V111G-V5 til stede både i en ustabil monomerisk form som er raskt degradert og i kompleks med NAA15, som stabiliserer enzymet og beskytter det fra degradering.