En 74 år gammel mann ble henvist til sin fastlege i august 2006 og klaget på hukommelsestap og ble deretter henvist til nevrolog. Han viste en rask global kognitiv nedgang assosiert med aggressivitet, bisarr oppførsel og språkproblemer. Dette ble ledsaget av alvorlig anomi, disinhibering og en score på 10/30 på MMSE. Det var ingen fokale tegn, myoklonus eller ataksi. Den kliniske forverringen var veldig rask og i desember 2006 var han i et akinetisk-mutisme-lignende syndrom med unormal holdning. To kranial magnetisk resonans (MRI), i oktober og desember 2006, inkludert T1, T2, FLAIR og DWI sekvenser, viste moderate tegn på hjerneatrofi, men ingen økning i unormale kortikale eller basal ganglia signaler. Elektroencefalogram (EEG) var ikke diagnostisk og protein 14-3-3 nivået i cerebrospinalvæsken (CSF) var normalt. Pasienten døde i mars 2007. Familiehistorien om demens inkluderte en 80 år gammel bror diagnostisert med sannsynlig Alzheimers sykdom. Ingen mutasjoner ble funnet i den åpne leserammen etter sekvensering av prionprotein-genet (PRNP). En heterozygose metioninvalin (MV) ble observert i kodon 129. Moderate til milde spongiforme forandringer var tilstede i neocortex, putamen/globus pallidus og thalamus, med lesjoner som var mer tydelige i putamen og frontal cortex. Konfluente vakuoler ble ikke funnet i noen region. Bortsett fra noen få fokale vakuoler i det dypere molekyllaget, var cerebellarkorteks ellers ukarakteristisk. Neuroner var stort sett bevart i cerebellarkorteks og basal ganglia selv om fokale astrogliose sjelden ble observert. Mild til moderate mikroglioser var tilstede i cerebellarkorteks og basal ganglia, og subkortikalt hvitt materiale, henholdsvis. Immunmerking av PrP uten proteinase K forbehandling viste sterk farging karakterisert ved fine punktformede avsetninger (synaptiske-lignende) og uregelmessige granulære, ofte konfluente, avsetninger som kunne kategoriseres som diffus synaptisk. Perineuronale og cerebellare plaque-lignende avsetninger, kuru plaque og floride plaque var fraværende. Etter PK behandling forsvant det store flertallet av farging, unntatt noen granulære PrP PK-resistente avsetninger. Cerebellum viste et diskret synaptisk-lignende mønster i molekyl- og granulære lag som forsvant etter PK forbehandling. Sensitivitet til PK forbehandling ble best visualisert i påfølgende snitt med og uten forbehandling med PK. Parallelle snitt farget med 3F4 antistoff viste markert reduksjon av PrP immunoreaktivitet, som ble vurdert ved densitometri, som involverte 70-80% av den totale PrP i vevssnitt. Dette ble ytterligere bekreftet ved inkubering av vevssnitt med 1E4 antistoff, og sammenligning av PrP immunohistokjemisk mønster av en sCJD MV1 tilfelle med proband. Som vist i figur, viste 3F4 og 1E4 synaptisk PrP immunoreaktivitet i det vanlige MV1 tilfelle resistent PrP immunoreaktivitet. I kontrast ble 3F4 og 1E4 immunoreaktivitet praktisk talt eliminert etter PK forbehandling i proband. I tillegg til disse endringene var nevrofibrillære tangler og pre-tangler, samt granuler (korn), tilstede i entorhinale og peri-rhinale cortices, subikulum og CA1 og CA3 regioner av hippocampus. Noen pre-tangler og korn ble også sett i amygdala. Disse endringene ble ledsaget av noen hyperfosforylerte tau-avsetninger i nevroner i dentate gyrus, spiralformede legemer i hvit substans i tinninglappen, og peri-ventrikulære astrocytter. Spredte αB-krystallin-immunreaktive ballongformede nevroner var tilstede i entorhinale cortex og amygdala. Tau patologi var i samsvar med Alzheimers sykdoms trinn III og argyrofilt korn sykdoms trinn 3. Amyloid plakk og α-synuclein inklusjoner var fraværende. Ingen abnormiteter ble funnet med anti-TDP-43 antistoffer. Standard PrP Western-blot prosedyre (10% hjerne homogenat og endelig PK konsentrasjon på 440 μg/ml) klarte ikke å oppdage PrPSc. Ved å øke volumet som ble lastet inn i gelen fra 5 til 10 μl ble det oppnådd et ekstremt svakt signal som tilsvarte 24 og 19 kDa under mettende filmeksponeringstider. Reduksjon av PK konsentrasjoner (440, 100 og 50 μg/ml) viste en økning i PrPSc signalet, som antydet et PK-sensitivt prionprotein. Selv da var bare to bånd på 24 og 19 kDa synlige. Etter å ha økt andelen hjerne homogenat til 20%, ble det samme to-bånd mønster oppnådd. Ved hjelp av TeSeE®-settet, som er kjennetegnet ved mykere PK-fordøyelsesbetingelser etterfulgt av trinn for rensing og konsentrasjon av proteinet og farging med Sha31 Mab, ble det avdekket to uventede bånd på 21 og 16 kDa. Dette båndprofilet ble observert i alle hjerneregionene og utgjorde et slående resultat, ettersom molekylvekten var forskjellig fra den som tidligere ble oppdaget med Mab 3F4 og 6H4. Utførelse av en kombinasjon av fordøyelse, rensing og konsentrasjon av prøven i henhold til TeSeE®-settets anbefalinger, sammen med påvisning ved hjelp av 3F4 og 6H4, ga et nytt mønster. Ikke bare var de tidligere båndene på 24, 21, 19 og 16 kDa til stede i hver av prøvene, men også et veldig svakt bånd på 28 kDa og et fragment på omtrent 6 kDa ble observert i noen hjerneregioner. Videre ble det oppnådd forskjeller i signalintensitet med 3F4 og 6H4 antistoffer som antydet forskjellig affinitet for PrPSc som kunne tolkes som en forskjellig proteinkonformasjon der 3F4-bindende epitop var mer eksponert enn 6H4-bindende epitop. Deglykosylering analyse avdekket tre aglykosylerte isoformer av 19, 16 og 6 kDa, som var mer intense i cortex (parietal, frontal og temporal) og svakere i occipital cortex og putamen/globus pallidus. I thalamus-regionen ble to bånd oppdaget, et mer intensivt bånd på 19 kDa og et svakere bånd på 16 kDa. Endelig var cerebellum det eneste området der et enkelt aglykosylert bånd på 19 kDa ble observert, tilsvarende det som ble funnet i sCJD type 2. Vi kan imidlertid ikke utelukke muligheten for at dette funnet var et resultat av tilstedeværelsen av en liten mengde PrPSc og en underrepresentasjon av de andre båndene, som observert i thalamus, der et bånd på 16 kDa bare ble observert under lengre eksponeringstid. Vurdering av følsomhet for PK-fordøyelse ble oppnådd ved å måle absorbanse av PrPSc før og etter behandling med protease K ved hjelp av IDEXX HerdChek BSE-testen. Denne teknologien er basert på selektivt PrPSc-innfanging av en spesifikk kjemisk polymer gjennom polyioniske interaksjoner i nærvær av PrPC fra en homogenatprøve av hjernen. Absorbansverdiene reduseres med seriefortynninger, så det kan antas at mengden av PrPSc er direkte proporsjonal med absorbanse. Målet med denne protokollen var å utføre relativ kvantifisering av PrPSc uten behandling med proteaser. Vi mener at innføringen av et fordøyelsestrinn kunne være nyttig for å enkelt evaluere den relative resistensen til PK-fordøyelse. Resultatene viste at absorbanseverdiene ble redusert etter PK-behandling i alle prøvene (tabell). For multi-infarkt encefalopati (MIE) og sCJD VV2 ble signaldeteksjonen redusert med henholdsvis 4,32 % og 2,02 %, men reduksjonene var ikke statistisk signifikante. I motsetning til dette viste prøvene fra proband og sCJD MM1 en statistisk signifikant (p < 0,005) reduksjon av signalet på henholdsvis 79,82 % og 22,68 %. Absorbansverdiene for MIE var under cut-off, på samme nivå som negative kontroller. De resterende verdiene var over cut-off. Disse differensierte nivåene av signalreduksjon indikerer tre nivåer av motstand mot PK-fordøyelse: høy, middels og lav. En høy motstand mot PK-fordøyelse ville bli representert av en lav prosentandel signalreduksjon, som observert for sCJD VV2. I dette tilfellet ville reduksjonen på 2 % i signalet indikere at PK-fordøyelsen bare ville nedbryte en minimal fraksjon av PrPSc, og dermed foreslå en høy motstand av det unormale prionproteinet. Middels motstand ville bli representert av en litt høyere prosentandel signalreduksjon som observert i sCJD MM1, der 22 % ville peke på en høyere nedbrytbar fraksjon av PrPSc enn den observert i det forrige tilfellet. Dette ville representere en proteintype som bare er litt sensitiv til nedbrytning med proteaser, avhengig av hjernegruppe. Videre undersøkelser blir utført for å klargjøre om dette nivået av nedbrytning er assosiert med MM1-proteintype eller et fenomen som er spesifikt for dette emnet. Endelig ville lav motstand mot PK-fordøyelse bli representert av en høy prosentandel signalreduksjon, for eksempel de 79 % observert i probanden, som indikerer at en høy fraksjon av PrPSc er nedbrytbar. Dette antyder eksistensen av unormale prionproteintyper som er ekstremt sensitive til proteasegjæring som potensielt kan bli oversett av påvisningsmetoder basert på den karakteristiske proteinase-resistensen til det patologiske prionproteinet.