En 4-årig eurasisk oterhann født i 2015 i "Sendaviva, Natural Park of Navarra" (42°11′31″N, 1°09′54”O) (Nordøst-Spania) ble overført til dyreparken "Terra Natura" (Sørøst-Spania) i 2017. Dyreparken "Terra Natura" ligger i de periurbane omgivelsene til Murcia by (38°00′40″N, 1°09′54”O). Otterburet besto av et område med fritt tilgjengelige skjul og en dam som inneholdt 4 dyr av denne arten (2 hanner og 2 hunner). Det ble ikke brukt noe anti-sandfly-insekticid på oteren. I august 2019 hadde dyret bilateral epistaxis, anoreksi, apati og vekttap, 12 % oppløsningsgel og 4 % stabelgel). De oppløste proteinene ble overført til en nitrocelluloseblatt (Bio-Rad, USA) og plassert i et ROTI®Lumin substrat (Carl Roth, Tyskland) for å blokkere i 2 timer ved romtemperatur. Det ble brukt et får-polyklonalt antistoff anti-hund IgG2 (AHP498; Bio-Rad, USA) ved 1:1000 fortynning som det primære antistoff, mens kanin anti-sau IgG-horseradise peroksidase (HRP)-konjugert (SAB3700702; Sigma-Aldrich, USA) ved 1:1000 fortynning ble brukt som det sekundære antistoff for å detektere det bundne primære antistoff. Signaldetekteringen ble gjort ved hjelp av en Pierce ECL2 kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA) og ble digitalisert i en Typhoon 9410 scanner (GE Healthcare, USA). Et bånd på omtrent 150 kDa ble observert i otterprøven så vel som i hundprøven (se figur og ytterligere fil). Disse funnene bekreftet at TR-IFMA-analysen ved hjelp av får-anti-hund IgG2 var i stand til å detektere otterens IgG2. TR-IFMA-analysen besto av en ikke-konkurrerende indirekte metode basert på biotinylert K39 rekombinant antigen som et fangstreagens, og anti-hund IgG2 polyklonalt antistoff (Får anti-hund IgG2, Bio-Rad, USA) Eu3 +-merket som en detektor. Testen inkluderte serum fra en syk Leishmania-seropositive hund som en positiv kontroll, og serum fra en sunn Leishmania-seronegative hund som en negativ kontroll. Analysen ble utført i en multilabel teller (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). Resultatene ble uttrykt som enheter av fluorometri for Leishmania (UFL). Grensen ble satt til 22 UFL. En enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Spain) ble også utført for å detektere spesifikke IgG antistoffer mot Leishmania spp. i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble fortyndet 1:20 og resultatene ble uttrykt som S/P-forhold, beregnet ved optisk densitet (OD) prøve/OD lav positiv kontroll. S/P-forhold over 1,1 ble ansett som positive. Leishmania spp. DNA i helblod og benmarg ble evaluert ved amplifikasjon av kinetoplast DNA-sekvensen til Leishmania spp. ved hjelp av en rtPCR med primere og prober som tidligere beskrevet []. Benmarg ble tatt gjennom en finnålsaspirasjon fra den costochondrale union og drenert i et 1 ml rør belagt med EDTA. DNA ble ekstrahert ved hjelp av High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Tyskland), etter produsentens instruksjoner. rtPCR ble utført i QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Den interne kontrollen TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, USA) ble inkludert. rtPCR ble utført i et endelig volum på 20 ul, inkludert 1 x iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, USA), 900 nM av hver primer, 200 nM av TaqMan probe, 1 x Exo IPC Mix, 1 x Exo IPC DNA og 50 ng DNA fra hver prøve. Syklingsparametrene var: 50 °C i 30 s, 95 °C i 10 min, 45 sykluser ved 94 °C i 30 s og 55 °C i 1 min. Hver amplifikasjonsrunde inkluderte positive og negative kontroller, og hver måling ble utført i triplikat. For identifikasjon av Leishmania-arter ble PCR-produktene fra de positive prøvene renset ved hjelp av High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Tyskland) og sendt til sekvensering ved avdelingen for molekylærbiologi ved Universitetet i Murcia. De oppnådde sekvensene ble sammenlignet med de tilgjengelige i GenBank. I tillegg ble de samme analysene utført på en 3 år gammel eurasisk oter fra den samme dyreparken uten kliniske tegn som var forenlig med leishmaniose, som en negativ kontroll. Alle resultatene vises i tabell. Forekomsten av leishmaniose ble bekreftet, og spesifikk behandling ble administrert (allopurinol 15 mg/kg/24 t/p.o.). Behandlingsovervåking ble utført i november 2019, etter 3 måneders behandling. Bilateral nefropati med hydronephrosis, mesenterisk lymphadenomegaly og ascites ble observert. CBC avslørte reduksjoner i hvite blodceller og reduksjoner i blodplater i den leishmania-positive oteren. Serumbiokjemisk profil for den leishmania-positive oteren viste hyperproteinemi, hyperglobulinemi, reduksjoner i PON-1 og økninger i haptoglobin og ferritin. Urinalysen avslørte proteinuri og reduksjoner i osmolaritet og spesifikk vekt. Tilstedeværelsen av anti-Leishmania IgG2 antistoffer og et positivt resultat ved RT-PCR i form av helblod og benmarg ble observert for den leishmania-positive oteren. Sekvensering av positive prøver bekreftet identifikasjonen av L. infantum. Den amplifiserte sekvensen viste 100 % likhet med en L. infantum referansesekvens. I tillegg ble ovale mikroorganismer med en eksentrisk kjerne som er kompatibel med Leishmania spp. amastigoter observert i cytologien til milten (Fig.