52 år gammel kvinne med historie om kolecystektomi og delvis reseksjon av venstre leverlob i 2004 på grunn av symptomatisk gallestein og flere intrahepatale galleveisleirer ble funnet å ha intermitterende feber og progressiv gulsott fra begynnelsen av november 2014. Bileveisobstruksjon og mistanke om malignitet i leverhulen ble oppdaget ved etterfølgende ultralyd, MR-kolangiopankreatografi (MRCP), MR-skanning og positronemisjonstomografi-computertomografi (PET-CT):). Eksplorativ laparotomi ble utført i slutten av november 2014 (Ytterligere fil: Figur S1) og fant alvorlig intra-abdominal adhesjon, en klump (1 × 2 cm) med indurert tekstur i den venstre leverkanalen og disseminert neoplastisk lesjon som infiltrerte leverhulen i den felles leverkanalen, hepatoduodenal ligament, de omkringliggende lymfeknuter, leverarterien, portalvenen og den celiaksen akse. Disse funnene tvang kirurgerne til å gi opp radikal reseksjon. Purulent galle ble utladet fra den felles kanalen, og slimpluggen stakk ut fra veggen i galleveien. Delvise neoplastiske lesjoner ble fjernet fra de forstørrede lymfeknutene, nubben i den venstre leverkanalen og kanten av den felles leverarterien for patologisk undersøkelse. T-kanal drenering ble installert for å lindre galleveisobstruksjon. Patologiske rapporter avslørte at naturen av tumoren var dårlig differensiert adenokarsinom med differensieringstegn av kolangocytter; i tillegg ble moderat EGFR-ekspresjon oppdaget i >90 % av tumorceller. Denne pasienten ble endelig diagnostisert som fremskreden, ikke-opererbar, perihepatisk CCA. Fem uker etter palliativ kirurgi mottok pasienten en 4-ukers kur med TOMO-terapi på den perihepatiske neoplasma (DT = 60 Gy/25 F), en syklus med systematisk kjemoterapi med albuminbundet paclitaxel alene for hennes intolerable gastrointestinale toksisitet og infusjonen av autologe cytokine-induserte killerceller. På grunn av den progressive økningen av CA199 ble PET-CT umiddelbart etter fullført radioterapi re-undersøkt og viste en ny, hypermetabolsk lesjon i den lever-caudate lob og forstørret blødt vev og retroperitoneal lymfeknude-metastase med abnorm standardisert opptaksverdi (SUV) mellom leveren og magen sammenlignet med PET-CT før radioterapi:). Fire uker etter radioterapi ble pasienten innrullert i CART-EGFR-studien. Hennes performance status var 1 i henhold til kriteriene fra Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Under forberedelsen av CART-EGFR celler utviklet hun høy feber, aggressiv gulsot og obstruksjon av galleveien, ledsaget av den kontinuerlige forhøyelsen av CA199 (fra 100,5 til 413,5 U/ml), aggressiv økning av total bilirubin, direkte bilirubin og andre galleveis-relaterte enzymologiske indekser og ble behandlet med effektive bredspektret antibiotika og endoskopisk galleveis-stent i lever-gallevejene. Studiene (ClinicalTrials.gov identifikator NCT01869166, NCT02541370) ble godkjent av institusjonens kontrollkomité ved det kinesiske PLA General Hospital. Ingen kommersiell sponsor var involvert i studiene. De registrerte pasientene ga skriftlig informert samtykke i henhold til Helsinkideklarasjonen. DNA-sekvensen av enkeltkjedet variabelfragment (scFv) som målretter EGFR-antigen ble avledet fra JQ306330.1 (GenBank-nummer). Anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta CAR ble generert og klonet inn i pWPT-lentiviral-skjelettet, beskrevet i detalj av Feng et al. []. Konstruksjonen ble verifisert ved DNA-sekvensering. En pseudotypiert, klinisk-grad lentiviral vektor-supernatant ble produsert ved standard transient transfeksjon som beskrevet av McGinley et al. []. I henhold til produsentens instruksjoner for Lipofectamine 3000 transfeksjonsreagens (Invitrogen, USA), ble pWPT-anti-EGFR CAR-plasmid, ps-PAX2-pakkingplasmid og pMD2.G-konvolutplasmid transfektert inn i 293 T-celler. Lentiviral-supernatantene ble samlet og lagret ved -80 °C. GFP-CD137-CD3zeta-vektoren ble konstruert for å verifisere transduksjonseffektiviteten ved hjelp av FACSCalibur-strømcytometri (BD Biosciences). DNA-sekvensen av scFv som målretter CD133-antigen ble avledet fra HW350341.1 (GenBank-nummer), generering, konstruksjon og testing av CART-EGFR-celler fulgte samme prosedyre som CART-EGFR-celler (Ytterligere fil: Figur S2). CART-celler ble produsert fra autologe perifere blodmononukleære celler (PBMC) samlet i celleprepareringsrør (BD Biosciences, San Jose, CA) renset fra 80 til 100 ml helblod ved den kinesiske PLA General Hospital Good Manufacturing Practice Facility i henhold til gjeldende standard driftsprosedyrer. PBMC ble stimulert med 50 ng/ml anti-CD3 MoAb (Takara, Japan) og 500 U/ml rekombinant humant interleukin-2 (Peprotech, USA) i GT-T551 medium (Takara). Lentiviral transduksjon ble utført i GT-T551 medium med protaminsulfat (Sigma) i 24 timer etter 2 dagers T-cellekultur. Deretter ble cellene ytterligere utvidet i kulturposer (Takara) og høstet som CART-celler. Bakterier, sopp og endotoksin ble testet før infusjonen av CART-celler. Immunofenotypen til CART-celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri med fluorescerende merkede antistoffer som er spesifikke for farging av CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L og CCR7. Isotype-matchede monoklonale antistoffer (BD Biosciences) ble brukt for kontrollfarging. CAR-ekspresjon ble estimert basert på GFP-CD137-CD3zeta-transduserte celler i samme batch for alle pasienter ved hjelp av strømningscytometri. Datainnsamling og analyse ble utført ved hjelp av en FACSCalibur-strømningscytometri (BD Biosciences). Cytotoksisitet in vitro av CART-EGFR-celler ble testet ved hjelp av samdyrking med EGFR-positive tumorceller ved forskjellige effektor-til-mål-forhold i 96-brønners plater ved hjelp av et 4-timers CCK-8 Detection kit (DOJINDO, Japan). Kvantitativ realtids-PCR (Q-PCR) ble brukt for å vurdere nivået av CAR fusjon gen i henhold til en tidligere beskrevet protokoll.13 Et 153-bp (basepar) fragment som inneholder deler av CD8a-kjeden og den tilstøtende 4-1BB-kjeden (forsideprimer 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ og reversprimer 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) ble amplifisert av ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Beta-aktin ble brukt som en intern kontroll. En 7-punkts standardkurve som besto av 100 til 108 kopier/ul plasmid DNA som inneholdt CAR-genet ble forberedt. Serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF og Granzyme B ble testet ved hjelp av en BD Biosciences mikrobead sandwich immunoassay i henhold til produsentens instruksjoner. Ifølge dyrkningssystemet som ble rapportert tidligere [], ble CART-EGFR-celler generert fra de mononukleære cellene i 80-100 ml av pasientens perifere blod og utgitt for infusjonene. Av de infusjonscellene under den første syklusen av CART-EGFR-terapi var 99,14 % CD3+-celler hovedsakelig sammensatt av CD8+-undergruppen (62,26 %), og 23,61 % ble karakterisert med den sentrale minnefenotypen (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). I tillegg var 8,99 % av de infusjonscellene EGFR-positive. Fenotypen og transfeksjonseffektiviteten av infusjonsceller av CART-EGFR i hver syklus er dokumentert i tabell. CART133 celler ble generert og dyrket i henhold til samme prosedyre som CART-EGFR celler. Av de infuserte cellene var 95,2 % CD3+ celler hovedsakelig sammensatt av CD8+ undergruppen (71,9 %), og 41,9 % var CD45RO+/CD62L+/CCR7+ undergruppen. I tillegg var 6,4 % av de infuserte cellene CD133 positive. Detaljer er dokumentert i tabell. På grunn av den nylig fullførte strålebehandlingen innen 2 måneder og intoleranse av kjemoterapeutiske midler ble pasienten administrert med 4-dagers suksessive infusjoner av 2,2 × 106/kg CART-EGFR celler totalt uten noen kondisjoneringsterapi, og oppnådde en PR i sin første vurdering 6 uker senere, evaluert i henhold til Response Evaluation Criteria in Solid Tumors versjon 1.1 (RECIST 1.1) med både MRI og PET-CT, som illustrerte en mer enn 80% krymping av metastatiske lesjoner i den hepatiske hilarregionen og caudate lob og en bemerkelsesverdig nedgang av SUV, sammen med en rask nedgang av CA199 fra 413,5 til 123,1 U/ml. CAR transgene kopiantall i pasientens perifere blod nådde en topp på 5916 pg/dl på dag 9 ledsaget med frigjøring av cytokiner som interleukin-6 (IL-6) og C reaktivt protein (CRP). Den andre syklusen av CART-EGFR monoterapi ble administrert med en dose av EGFR-CAR+ uttrykkende T celler 2,1 × 106/kg og uten noen pre-kondisjonering behandling fordi CAR transgene kopiantall i perifert blod falt nær baseline nivå 2 måneder etter den første infusjonen av CAR-EGFR uttrykkende genetisk modifiserte T celler. Rutinøse undersøkelser av MRI og PET-CT viste en vedvarende PR ledsaget med en ytterligere reduksjon av CA199 til 61,2 U/ml. Interessant, toppen av CAR transgene kopiantall etter den andre syklus infusjon av CART-EGFR celler nådde ikke et parallelt eller høyere nivå som den første syklus av CART-EGFR terapi gjorde. PR statusen til pasienten ble opprettholdt i 8,5 måneder inntil hun utviklet hyppig uhåndterlig oppkast, øvre abdominal kjedelig smerte og gastrisk syre refluks, som skjedde i midten av november 2015. Den påfølgende elektroniske gastroskopi viste striktur i duodenal bulb, og PET-CT bekreftet tumor progresjon med illustrasjon av flere nye SUV abnormale lesjoner i omentum majus, peritoneum, og abdominal hulrom. Pasienten ble deretter behandlet med 1 syklus av CART-EGFR-terapi kombinert med 2 sykluser av anti-programmerte celledødsprotein 1 (PD-1) monoklonalt antistoff (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), som ble administrert i en dose på 100 mg hver 2. uke. På samme måte nådde ikke CAR-transgenkopienivået i perifert blod en tilsvarende toppnivå fra den første syklusinfusjonen selv kombinert med anti-PD-1 antistoff. Til tross for at serum CA199 falt midlertidig fra 326,3 til 210,8 U/ml, oppdaget den følgende PET-CT nylig fremvoksende metastaser i bunnen av bekkenet, høyre leverlob og venstre supraklavikulær lymfeknude samt utvidelse av tidligere tumorlesjoner i magen sammenlignet med PET-CT før den kombinerte immunterapi. På grunn av at mer enn 90 % av svulstcellene uttrykte CD133-protein (Tilleggsfil: Figur S3), ble pasienten deretter inkludert i CART133-studien og fikk infusjon av 1,22 × 106/kg CD133-spesifikke CART-celler uten kondisjonerende behandling. På grunn av forekomst av obstruksjon i den nedadgående duodenum og den resulterende vedvarende alvorlige infeksjon i galleveiene samt leverabscess, som kan påvirke nivået av serum CA199 og ble behandlet med antibiotika, ble den planlagte bildediagnostikk-evalueringen utsatt til 2 måneder etter infusjonen av CART133-celler, hvor kontrastforsterket CT viste en bemerkelsesverdig krymping eller til og med forsvinning av noen metastaser i bukhulen og bukhulen, som førte til en evaluering av PR. CAR-transgenkopien i perifert blod (PB) svingte fra 377 til 919 pg/dl. Pasienten følte vedvarende kjedelig smerte i øvre del av magen 2,5 måneder senere, og den etterfølgende CT-skanning oppdaget en omtrent 40 × 70 mm ny metastatisk lesjon under abdominalveggen og mistenkte metastaser i bukhulen ledsaget av CAR-transgenkopien i PB som sank nær baseline-nivå, og trakk en konklusjon om progressiv sykdom (PD). Bivirkninger som kulderystelser, feber, tretthet, oppkast og muskelsmerter som oppstod under infusjonen av CART-EGFR-celler var vanligvis milde, tolerable og kunne håndteres med støttebehandling. Imidlertid utviklet pasienten en 9-dagers lavere feber uten kulderystelser, hoste, diaré eller andre infeksjonssymptomer fra den tredje dagen etter infusjonen av CART-celleinfusjonen. Gjentatt laboratorieundersøkelse av PB viste normalt antall hvite blodceller, neutrofilforhold, negativ procalcitonin (PCT) og blodkulturer, som ikke støttet diagnosen infeksjon, men i mellomtiden eskalering av IL-6 og CRP og akutt økning av glutamisk-pyruvisk transaminase og glutamisk-oksalacetisk transaminase (>6ULN). Det var noen spredte små utslett som dukket opp i venstre lår 2 uker etter den første syklusinfusjonen av CART-EGFR-celle, som gradvis ble verre og ble tydelig og kløende med presentasjon av flere flaky eller lineære utslett som spredte seg fra venstre lår til kalven og fusjonerte sammen, som ble gradert 2 i henhold til den felles terminologikriterier for bivirkninger 4.0 (CTCAE 4.0), da den andre syklus av CART immunterapi ble fullført. Utslettene ble tatt biopsi med illustrasjon av lichen striatus-lignende patologiske endringer som tap av delvis epidermis, vakuolær degenerasjon av basalceller og infiltrasjon av mange T-lymfocytter i epidermis og dens vedheng, og ble håndtert vellykket med takrolimus salve. Ingen hypotensjon forekom under hele CART-EGFR-behandlingen. Bortsett fra mild kvalme, brekninger, frysninger, feber og tretthet, var det ingen andre akutte bivirkninger i løpet av kombinasjonsbehandlingen. Selv om flass dukket opp og ble verre etter den kombinerte immunterapi, var det ikke behov for medisinske inngrep. Serumnivåer av cytokiner som tumor nekrosefaktor-α (TNF-α), IL-6 og CRP ble litt forhøyet og induserte ikke noen symptomer på cytokinfrigjøring. Under infusjonen av suksessive dose-eskalerende CART133 celler over 4 dager, var det ingen andre uønskede hendelser unntatt infusjonsrelatert mild feber og tretthet. Men den andre morgenen etter at infusjonen av CART133 celleinfusjonen var fullført, utviklet denne pasienten intermitterende øvre abdominal kjedelig smerte, frysninger, feber (39,1 °C), sporadiske små blødninger, og kongestiv utslett på hennes kalver, som spredte seg raskt og diffus til hennes nakke, høyre overarm, bryst, venstre mage, og retropharyngeal slimhinne ledsaget av kløe og diaré den ettermiddagen og ble ytterligere forverret i de følgende 10 dagene og programert celledødligand 1 (PD-L1) [, ], som resulterer i et raskt tap av deres cytolytiske og cytokinsekresjonskapasitet og en tilstand av hyporesponsivitet [] I tillegg viser faste tumorer ofte metabolske avvik ved overforbruk av viktige aminosyrer som er kritiske for T-celleaktivitet og induserer hypoksi og en resulterende surgjøring av den ekstracellulære matriks på grunn av utilstrekkelig vaskulær forsyning som er fiendtlig for T-celleoverlevelse [] Dermed er det nødvendig med en modulering av tumor-mikromiljøet for å forbedre resultatene. I dette tilfellet ble pasienten behandlet med 60 Gy strålebehandling før immunterapi med omtrent en måneds intervall fra slutten av strålebehandlingen til begynnelsen av CART-celleinfusjonen. Selv om strålebehandlingen i seg selv ikke klarte å utrydde tumorceller effektivt, kan dens direkte og forsinkede effekt spille en rolle i å ødelegge det tumor-støttende stroma, endre biologien til tumor-mikromiljøet, fremme frigivelsen av flere tumor-assosierte antigener og forbedre immungjenkjenning [] Videre kan strålebehandlingen gjøre tumorene mer immunogene og mer mottagelige for et forbedret angrep av immuncellene [], og til og med generere antitumor-effekter i de fjerne metastaser som ikke ble lokalt bestrålt (referert til som den abskopale effekt) [, ]. Vi legger derfor fram en hypotese om at strålebehandling kan være en rimelig og effektiv kondisjonerende terapi for å forbedre resultatet av CART-terapi. Da resistansen mot CART-EGFR-terapi ble bekreftet, prøvde vi en gang en immunterapi-kombinasjon med anti-PD-1-antistoff i forbindelse med CART-EGFR-celleinfusjon på grunnlag av en preklinisk studie som viste at blokkering av PD-1-immunsuppresjon kunne forbedre den terapeutiske effekten av CART-cellebehandling mot etablerte solide tumorer [] Dessverre endte denne behandlingen i en fiasko med PET-CT som bekreftet sykdomsprogresjonen, selv om CA199 ble redusert midlertidig. En mulig forklaring er det uklare nivået av PD-L1-ekspresjon. Nylig ble PD-L1-ekspresjon fremhevet for verdien av å forutsi den terapeutiske effekten av anti-PD-1-legemidler. Imidlertid var tumorlesjonen i dette tilfellet vanskelig å biopsere på grunn av dens anatomiske plassering, som resulterte i at nivået av PD-L1-proteinekspresjon på tumorceller ikke kunne oppdages nøyaktig før initiering av anti-PD-1-terapi, som eksisterer en mulighet for at PD-L1-ekspresjon i tumormilieu kan være på et lavt nivå eller til og med negativt og derfor føre til at anti-PD-1-behandlingen mislykkes. I mellomtiden var det mange andre parallelle kontrollveier som potensielt kunne støtte resistensen mot anti-PD-1-terapi [] Under denne situasjonen var det avgjørende å velge et rasjonelt mål for neste trinn i pasientbehandlingen. Nylig har CSC i CCA tiltrukket stor oppmerksomhet på grunn av deres svært kreftfremkallende egenskaper og sentrale roller i å formidle selvfornyelse, tumor-gjenvekst og terapeutisk resistens, og følgelig er terapi som er målrettet mot overflatemolekylmarkører og signalveier som er spesifikke for CSC, en mulig potent mulighet for CCA [, ]. Blant molekylene som brukes individuelt eller i kombinasjon for å identifisere kolangiocarcinom-stamceller, er CD133 en av de viktigste stamcelle-markørene som er forbundet med høyere invasivitet og dårligere prognose [] Shien og kolleger rapporterte også at CD133-positive tumorceller viste større resistens mot postoperativ behandling enn CD133 negative celler, og økt CD133-ekspresjon ble observert i resterende kreftceller etter adjuvant terapi [] Basert på det ovenstående valgte vi endelig CD133 som målantigen for CART-immunterapi, som igjen produserte en annen delvis respons, og viste videre at CART-cocktail-immunterapi kan være gjennomførbar og rasjonell. En annen viktig bekymring var toksisiteten som kunne induseres av CART-EGFR-cellene på de målrettede antigener som ble uttrykt på svulstceller og/eller synkront på normale vev, kalt "on-target off-tumor effect". Skader på normale vev kunne til og med oppstå ved uventede kryssreaksjoner med et protein som ikke ble uttrykt på svulstceller []. Siden infusjonen av CART-EGFR-cellene startet, opplevde denne pasienten ikke bare feber, frysninger og tretthet, men også vedvarende pyreksi, akutt økning av serumtransaminaser og forsinket utbrudd av hudutslett, ledsaget av en robust økning i CAR-transgenkopier, IL-6 og CRP, selv om nivåene ikke møtte kriteriene for diagnostisering av cytokinfrigjørende syndrom [, ]. De massive cytokiner som kunne produseres direkte av de infuserte CART-cellene reflekterte en sterk immunrespons som kunne generere både antitumorvirkninger på svulstceller og bivirkninger på normale vev. I tillegg var on-target off-tumor-effekten forårsaket av CART-EGFR-cellene sannsynligvis grunnen til utløsningen av dermatologiske toksisiteter på grunn av fordelingen av EGFR på epidermis []. Imidlertid var alle disse bivirkningene milde, reversible og ble håndtert med støttende behandling og topikal kortikosteroid. Tilsetningen av anti-PD-1-antistoff forverret tilsynelatende ikke toksisitetene av CART-EGFR-immunterapi i dette tilfellet. Ikke desto mindre ble denne pasienten i den påfølgende behandlingen av infusjon av CART133-celler utsatt for alvorlige dermatologiske, orale slimhinne- og gastrointestinale toksisiteter som kongestiv utslett og blødning. Selv om disse toksisitetene ble håndtert med suksess ved akutt medisinsk intervensjon inkludert intravenøs methylprednisolon og anti-TNF-inhibitor, kan den iboende mekanismen i stor grad skyldes on-target off-tumor-effekten av CART133-celler som målrettede på CD133-antigenet uttrykt på normalt epitel og vaskulært endotel. Samtidig var det uklart om anti-PD-1-antistoff og resterende CART-EGFR-celler in vivo kunne spille en rolle i forverringen av toksisitetene av CART133-immunterapi.