En 47 år gammel kvinne (vekt: 62 kg) ble diagnostisert med kronisk aktiv HBeAg-positiv hepatitt B i 1996. Virale parametere som HBeAg, anti-HBe IgG og HBV plasma viral load fra frosne prøver ble målt samtidig av en unik operatør for å redusere intra- og inter-assay variasjoner. HBeAg og anti-HBe ble bestemt ved elektrokjemiluminescens (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). HBV viral load nivåer ble bestemt ved real time PCR (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, dynamisk område 30 IU/ml til 110,000,000 IU/ml) []. Leverbetennelse ble målt ved serum alanin aminotransferase (ALT) nivåer. For sekvensanalyse ble HBV pol og preC-core gener sekvensert med primere som beskrevet tidligere []. Analysen ble utført ved hjelp av et ABI3100 instrument (Applied Biosystems), og sekvensene introdusert i dette arbeidet samt de som ble oppnådd fra GenBank databasen ble justert med ClustalX v1.83 [] og redigert med Bioedit v7.0.9.0 [] HBV genotype ble vurdert ved hjelp av fylogenetisk slutning ved hjelp av Neighbor-joining algoritmen med Kimura-to-parameter modellen av molekylær evolusjon i MEGA v3.1 programvare [] Sekvenser fra begge gener ble oppnådd på forskjellige tidspunkter under antiviral terapi. En mer detaljert HBV pol gen klonal analyse ble utført på syv utvalgte virusisolater fra serumprøver høstet under sekvensiell terapi. Hvert utvalgte PCR produkt av pol gen ble klonet i pGEM-T Easy vektor i henhold til produsentens instruksjoner (Promega, Wisconsin, USA) og minst 15 kloner ble ytterligere analysert ved sekvensering. Dette tillot å analysere utviklingen av virus kvasispesies under de suksessive antivirale pressene basert på analyse av pol gen. Intervensjonene med anti-HBV-behandling ble fulgt av HBV-viral belastning og ALT-nivå kinetikk som er vist i figur. Terapi ble initiert når HBV viral belastning steg til 6,5 × 106 IU/ml. I 1998 da pasienten ble behandlet med IFN-alfa 5 MU tre ganger ukentlig i 30 uker, var HBV DNA nivået lavere enn detekteringsgrensen. Denne terapien ble avbrutt og erstattet i 1999 med lamivudin (150 mg en gang daglig). Etter 2 års kontinuerlig behandling var HBV DNA detekterbar (15,5 × 106 IU/ml). HBeAg forble negativ med detekterbar anti-HBe under denne perioden av behandlingen. I 2001, etter en 6 måneders avbrudd, viste HBV DNA nivået en post-behandlings flare (1 × 108 IU/ml). På slutten av 2003 ble lamivudin terapi reintrodusert (150 mg en gang daglig). Det ble fulgt av en sjelden hendelse av reversering til en HBeAg-positiv/anti-HBe negativ profil, som forble detekterbar i to år. Viral belastning nådde 3,1 × 106 IU/ml på dette tidspunktet. Ti måneder senere, i 2006, ble lamivudinregimet erstattet med adefovirmonoterapi (10 mg/dag). I utgangspunktet var virusbelastningsnivåene lave (8,5 × 104 IU/ml), men etter 48 ukers behandling nådde disse nivåene 7,15 × 106 IU/ml. ALT-nivåene var normale i løpet av dette intervallet. Reaktivisering av HBV-replikasjon ble antatt å være en faktor, tatt i betraktning den samtidige påvisningen av HBeAg/anti-HBe [] og den høye replikasjonen som ble oppdaget. Sammensetningen av HBeAg og anti-HBe ser ikke ut til å være uvanlig blant antiviral behandlingsnaive pasienter, men dens prevalens hos terapierfarte pasienter er ukjent. Dette serologiske mønsteret har vært knyttet til omfattende hepatocyttskade og alvorlig immunmediert leverskade og påfølgende dysfunksjon []. Seks måneder senere økte ALT-nivået svakt (1,5 × øvre normalgrense - UNL -), og entecavirmonoterapi ble satt i gang (1 mg daglig). Etter 5 måneders entecavir monoterapi ble tenofovir (300 mg en gang daglig) lagt til behandlingsprogrammet for dobbelterapi. HBV DNA gikk ned til 1 × 105 IU/ml i fire måneder, men tre måneder senere nådde virusmengden > 1,1 × 108 IU/ml. I tillegg indikerte en økning i ALT-nivået (20× UNL) leverbetennelse. I løpet av de følgende 48 ukene gikk virusreplikasjonen litt ned til 6,1 × 106 IU/ml, men økte igjen først til 3,6 × 107 IU/ml og senere til > 1,1 × 108 IU/ml. I nyere tid (andre semester 2010) svingte HBV DNA-nivåene mellom 4,3 × 104 IU/ml og 4,9 × 107 IU/ml. Ved slutten av oppfølgingsstudien kunne vi måle tenofovirkonsentrasjonen i plasma ved høy ytelsesvæskekromatografi i tre påfølgende prøver 20 timer etter administrasjon, og den var 71,6 ng/ml ± 47,6 (gjennomsnitt ± SD). ALT-AST nivåene forble litt forhøyet (2× UNL) i løpet av de siste to årene av oppfølging. HBV-isolater fra pasienten ble tilskrevet genotype A2 basert på fylogenetisk slektskap blant partielle HBV genomiske sekvenser fra både pol- og preC-C-gener. En ytterligere longitudinal genotypisk analyse, inkludert kvasispesiesammensetning av HBV-stammer isolert fra pasienten, avslørte tilstedeværelsen av resistensmutasjoner basert på pol-gensekvenser (tabell). Ved begynnelsen av lamivudinbehandlingen var HBV villtype i alle kloner. Etter 2 år under slik behandling ble denne viruspopulasjonen fullstendig erstattet av mutasjon rtM204I - homogent viser lamivudinresistens. Når slik behandling ble avbrutt i 6 måneder, besto kvasispesiesammensetningen nesten utelukkende av villtype pol-nukleotidsekvenser, unntatt et mindre bidrag (< 10%) som viste adefovir-resistensassosiert mutasjon I233V. Når lamivudinbehandlingen ble gjeninnført, og inntil entecavir pluss tenofovir ble administrert, ble de to lamivudin-resistensassosierte mutasjonene rtL180M og rtM204I alltid oppdaget. Under sistnevnte terapeutiske regime ble bare ephemeralt og med mindre bidrag (< 10%) adefovir-resistensassosiert mutasjon A181T og T184L lamivudin-adefovir og entecavir-resistensassosiert mutasjoner oppdaget. I tillegg ble det oppdaget to andre varianter i det katalytiske domenet i revers transkripsjons-enzymet på tidspunktet for lamivudinresistens. Disse rtA200V og rtI253V variantene var fortsatt tilstede under entecavir-terapi, og ble også oppdaget i prøver sekvensert etter gjennombrudd under entecavir-terapi. Den genomiske karakteriseringen av HBV på preC-C-nivå viste tilstedeværelse av en dobbel mutasjon av A1762T og G1764A som ble oppdaget tidlig da pasienten ikke ble behandlet, og forble i denne tilstanden under hele oppfølgingen. T1753C-mutasjonen ble også oppdaget konsekvent. Tilstedeværelsen av disse kjernepromotormutasjonene er også relatert til den ovennevnte HBeAg-antiHBe-samtidige profilen som ble funnet hos denne pasienten, som nylig ble rapportert [].