La paziente è una bambina di 11 anni, nata tre settimane prima del termine per taglio cesareo a causa di una posizione trasversale, con un peso alla nascita di 2720 g. Non ci sono state difficoltà di alimentazione nell'infanzia o successivamente. Lo sviluppo motorio e linguistico è stato ritardato: ha camminato senza supporto a 2 anni e mezzo, e a 3 anni ha detto le sue prime parole. A 10 anni conosceva l'alfabeto e ha provato a mettere insieme le lettere. Ha usato i pannolini fino all'età di 8-9 anni. Il suo sonno è leggermente irregolare con frequenti risvegli. Non sono mai state rilevate malformazioni congenite o epilessia. Ha una statura normale con una lunghezza lungo il 25°-50° centile e un peso lungo il 25° centile, ma la sua circonferenza cranica è nella gamma normale inferiore (2,5°-5° centile). Le sue caratteristiche facciali sono anche normali - non è chiaramente dismorfica. Il comportamento è normale senza tratti autistici, ma il bruxismo è un problema. Preferisce la compagnia di bambini più piccoli. Il suo livello intellettuale è giudicato paragonabile a quello di un bambino con disabilità intellettiva lieve-moderata, non sono ancora stati fatti test formali di QI. A 9 anni, la sequenziamento dell'intero esoma (WES) del trio, confrontando il DNA del bambino con quello dei genitori, ha rivelato una variante de novo NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G, che è stata ulteriormente confermata dal sequenziamento di Sanger. In linea con altre varianti missenso di NAA10, la sostituzione V111G influenza un amminoacido altamente conservato. NAA10 è una proteina di 235 amminoacidi che adatta la caratteristica piega GNAT comune alle subunità catalitiche NAT. Questa piega è composta da sei o sette catene β e quattro a-eliche. Le catene β 2-5 costituiscono il nucleo della proteina. Queste quattro catene β, insieme con la a-2-elica e il β6-β7 loop importante per il legame con il substrato, sono altamente conservate. V111 è posizionata verso la fine della catena β5, e una valina in questa posizione è altamente conservata nelle omologhe di NAA10 e in diverse altre subunità catalitiche NAT per le quali sono state risolte le strutture cristalline, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) e 4LX9 (ssNAT)) [–]. La catena laterale di V111 forma una tasca idrofobica insieme a Y145, M147, L119 e L109. È inoltre molto vicina (3.7 Å) al gruppo zolfo di Acetil-CoA (AcCoA), il che potrebbe indicare un ruolo di V111 nel posizionamento di AcCoA. Una glicina in questa posizione non causerà alcun scontro sterico, ma la perdita della più voluminosa catena laterale idrofobica di valina potrebbe causare alterazioni strutturali che influiscono sulla stabilità della proteina o sul legame con AcCoA. Per valutare funzionalmente il NAA10-V111G, abbiamo prima espresso l'His/MBP-NAA10-WT e l'His/MBP-NAA10-V111G in E. coli, purificato gli enzimi e testato l'attività NAT in vitro. Contrariamente all'His/MBP-NAA10-WT, è stato difficile ottenere una buona espressione proteica dell'His/MBP-NAA10-V111G, e una frazione sostanziale delle molecole purificate di His/MBP-NAA10-V111G è stata eluita nel volume vuoto della colonna di cromatografia di esclusione dimensionale. Ciò indica che parti della proteina si sono aggregate in unità più grandi di 200 kDa, molto probabilmente a causa di un'alterazione della struttura della proteina o di una ridotta stabilità della proteina. Gli enzimi che sono stati eluiti in un volume di colonna corrispondente a quello dell'His/MBP-NAA10-V111G monomerico sono stati testati per l'attività catalitica e hanno mostrato una riduzione di circa l'85% dell'attività catalitica rispetto all'His/MBP-NAA10-WT. A causa dei bassi livelli di espressione e della bassa resa proteica di NAA10-V111G da E. coli, abbiamo sottoposto le cellule HeLa a transfezione con plasmidi codificanti per NAA10-WT V5 o NAA10-V111G V5, seguita da immunoprecipitazione (IP) della proteina sovraespressa con un anticorpo anti-V5. Successivamente, è stata misurata l'attività NAT nel precipitato. NAA10 e NAA15 formano un complesso proteico ad alta affinità, e come previsto, la NAA15 endogena è stata co-immunoprecipitata sia con la NAA10-WT V5 sovraespressa che con la NAA10-V111G V5. La quantità di NAA10 e NAA15 presente in ogni campione è stata determinata mediante SDS-PAGE e Western blot. Le bande del Western blot sono state quantificate, e l'attività catalitica misurata è stata correlata alla quantità di NAA10-V5 presente nel campione (ovvero una miscela di NAA10 monomerica e NAA10 complessata con NAA15 - il complesso NatA), e separatamente correlata alla quantità di NAA15 presente nel campione (ovvero la quantità di complesso NatA). I risultati dell'esperimento di attività IP sono stati ben correlati con la nostra precedente scoperta: la capacità di NAA10-V111G di acetilare il N-terminale acido EEEI24 è stata fortemente ridotta. Tuttavia, ha rivelato anche una seconda interessante caratteristica: come si può vedere dal Western blot nella Fig., più NAA15 è stata co-immunoprecipitata con NAA10-V111G-V5 rispetto a NAA10-WT-V5. Ciò si è riflesso anche nelle nostre misurazioni di attività NAT, dove il campione di NAA10-V111G-V5 ha mostrato una maggiore formazione di prodotto NatA (per il polipeptide SESS24, substrato di NatA) rispetto al campione di NAA10-WT-V5, quando correlato alla quantità di NAA15 presente nel campione. Tuttavia, quando correlato alla quantità di NAA15 presente in ogni campione, la formazione di prodotto NatA per molecola di NAA15 (e quindi complesso NatA) è stata approssimativamente uguale. Poiché il monomero NAA10 ha una NAT-attività 1000 volte inferiore rispetto al complesso NatA [], il contributo del monomero NAA10 all'acetilazione di SESS24 è minimo. In sintesi, ciò suggerisce che NAA10-V111G ha una ridotta attività catalitica in forma monomerica, ma non in forma complessata con NAA15. Per valutare il turnover proteico di NAA10-WT e NAA10-V111G, abbiamo espresso le molecole di NAA10-WT e NAA10-V111G etichettate con V5 in cellule HeLa e abbiamo eseguito esperimenti di cattura con cicloesimmide. Come si può vedere dalla figura, la molecola di NAA10-V111G-V5 ha un turnover più elevato rispetto a quella di NAA10-WT-V5. Due ore dopo il trattamento con cicloesimmide, la quantità media di molecole di NAA10-V111G-V5 è stata ridotta di circa l'80%, mentre quella di molecole di NAA10-WT-V5 è stata ridotta del 20% rispetto alla quantità di molecole di NAA10 prima del trattamento con cicloesimmide. Sebbene la quantità di molecole di NAA10-V111G-V5 sia drasticamente diminuita dopo due ore, il livello di molecole di NAA10-V111G-V5 sembra stabilizzarsi intorno al 20%. Molto probabilmente, la sovraespressione di NAA10-V111G-V5 è presente sia in una forma monomerica instabile che viene rapidamente degradata, sia in un complesso con NAA15, che stabilizza l'enzima e lo protegge dalla degradazione.