Un uomo di 74 anni si è presentato al suo medico di base nell'agosto 2006 lamentando una perdita di memoria e poi è stato indirizzato al neurologo. Ha mostrato un rapido declino cognitivo globale associato ad aggressività, comportamento bizzarro e perdita del linguaggio. Ciò è stato accompagnato da grave anomia, disinibizione e un punteggio di 10/30 sul MMSE. Non c'erano segni focali, mioclono o atassia. Il deterioramento clinico è stato molto rapido e nel dicembre 2006 si è trovato in una sindrome simile ad acinetico-mutismo con postura anomala. Due risonanze magnetiche (MRI) del cranio, nell'ottobre e nel dicembre 2006, tra cui sequenze T1, T2, FLAIR e DWI, hanno mostrato segni moderati di atrofia cerebrale ma nessun aumento del segnale corticale o dei gangli basali anomalo. L'elettroencefalogramma (EEG) non è stato diagnostico e il livello di proteina 14-3-3 nel liquido cerebrospinale (CSF) era normale. Il paziente è morto nel marzo 2007. La storia familiare di demenza includeva un fratello di 80 anni a cui era stata diagnosticata una probabile malattia di Alzheimer. Non sono state riscontrate mutazioni nel quadro di lettura aperto dopo il sequenziamento del gene della proteina prionica (PRNP). Nel codone 129 è stata osservata un'eterozigosi metionina valina (MV). Un cambiamento spongiforme da moderato a lieve era presente nel neocortex, nel putamen/globus pallidus e nel talamo, con le lesioni più evidenti nel putamen e nella corteccia frontale. Non sono state riscontrate vacuole confluenti in nessuna regione. Fatta eccezione per alcune vacuole focali nello strato molecolare più profondo, la corteccia cerebellare era altrimenti priva di anomalie. I neuroni erano in gran parte preservati nella corteccia cerebellare e nei gangli basali, sebbene un'astrogliosi focale fosse raramente osservata. Una microgliosi da moderata a lieve era presente nella corteccia cerebellare e nei gangli basali, e nella sostanza bianca subcorticale, rispettivamente. L'immunocolorazione di PrP senza pre-trattamento con proteinasi K ha mostrato una forte colorazione caratterizzata da depositi sottili e puntiformi (simili a quelli sinaptici) e depositi granulari irregolari, spesso confluenti, che potevano essere classificati come sinapsi diffuse. I depositi perineuronali e cerebellari a forma di placca, le placche di kuru e le placche floride erano assenti. Dopo il trattamento con PK, la maggior parte della colorazione è scomparsa, ad eccezione di alcuni depositi granulari resistenti alla PK di PrP. Il cervelletto mostrava un modello sinaptico discreto simile a quello molecolare e granulare, che scompariva dopo il pre-trattamento con PK. La sensibilità al pre-trattamento con PK è stata meglio visualizzata in sezioni consecutive con e senza pre-trattamento con PK. Le sezioni parallele colorate con l'anticorpo 3F4 hanno mostrato una marcata riduzione dell'immunoreattività di PrP, come valutata mediante densitometria, coinvolgendo il 70-80% della PrP totale nelle sezioni di tessuto. Ciò è stato ulteriormente confermato incubando le sezioni di tessuto con l'anticorpo 1E4 e confrontando il modello immunoistochimico di PrP di un caso di sCJD MV1 con quello del probando. Come mostrato nella Figura, la sinapsi PrP immunoreattiva di 3F4 e 1E4 nel caso comune MV1 mostrava una resistenza all'immunoreattività di PrP. Al contrario, l'immunoreattività di 3F4 e 1E4 è stata praticamente abolita dopo il pre-trattamento con PK nel probando. In aggiunta a questi cambiamenti, erano presenti grovigli neurofibrillari e pre-grovigli, così come granuli (grani), nella corteccia entorinale e peririnale, nel subicolo e nelle regioni CA1 e CA3 dell'ippocampo. Alcuni pre-grovigli e grani erano presenti anche nell'amigdala. Questi cambiamenti erano accompagnati da alcuni depositi di tau iperfosforilati nei neuroni del giro dentato, da corpi a spirale nella sostanza bianca del lobo temporale e da astrociti peri-ventricolari. Nell'entorechina e nell'amigdala erano presenti neuroni a forma di palloncino immuno-reattivi alla aB-cristallina. La patologia tau era coerente con la fase III della malattia di Alzheimer e con la fase 3 della malattia dei grani argirofili. Le placche amiloidi e le inclusioni di a-sinucleina erano assenti. Non sono state riscontrate anomalie con gli anticorpi anti-TDP-43. La procedura standard di Western blot per la PrP (10% di omogeneato cerebrale e concentrazione finale di PK di 440 μg/ml) non è riuscita a rilevare la PrPSc. Aumentando il volume caricato nel gel da 5 a 10 μl si è ottenuto un segnale estremamente debole corrispondente a 24 e 19 kDa con tempi di esposizione della pellicola di saturazione. Diminuendo le concentrazioni di PK (440, 100 e 50 μg/ml) si è osservato un aumento del segnale della PrPSc, che ha fatto pensare a una proteina prionica PK-sensibile. Anche allora, erano visibili solo due bande di 24 e 19 kDa. Dopo aver aumentato la percentuale di omogeneato cerebrale al 20%, si è ottenuto lo stesso schema a due bande. Utilizzando il kit TeSeE®, caratterizzato da condizioni di digestione PK più morbide seguite da fasi di purificazione e concentrazione della proteina e colorazione con Sha31 Mab, è stata rivelata la presenza di due bande inaspettate di 21 e 16 kDa. Questo profilo di banda è stato osservato in tutte le regioni del cervello e ha costituito un risultato sorprendente, poiché il loro peso molecolare era diverso da quello rilevato in precedenza con Mab 3F4 e 6H4. L'esecuzione di una combinazione di digestione, purificazione e concentrazione del campione secondo le raccomandazioni del kit TeSeE®, insieme alla rilevazione con 3F4 e 6H4, ha prodotto un nuovo pattern. Non solo le precedenti bande di 24, 21, 19 e 16 kDa erano presenti in ciascuna delle campioni, ma anche una banda molto debole di 28 kDa e un frammento di dimensioni approssimativamente pari a 6kDa sono stati osservati in alcune regioni del cervello. Inoltre, sono state ottenute differenze di intensità del segnale con gli anticorpi 3F4 e 6H4, suggerendo un'affinità differenziale per PrPSc che potrebbe essere interpretata come una diversa conformazione della proteina in cui l'epitopo di legame 3F4 era più esposto di quello di 6H4. L'analisi della deglicosilazione ha rivelato tre isoforme aglicosilate di 19, 16 e 6 kDa, più intense nella corteccia (parietale, frontale e temporale) e più deboli nella corteccia occipitale e nel putamen/globus pallidus. Nella regione del talamo sono state rilevate due bande, una più intensa di 19 kDa e una più debole di 16 kDa. Infine, il cervelletto è stata l'unica regione in cui è stata osservata una singola banda aglicosilata di 19 kDa, simile a quella riscontrata nella sCJD di tipo 2. Tuttavia, non possiamo escludere la possibilità che questo risultato sia stato il risultato della presenza di una piccola quantità di PrPSc e di una sottovalutazione delle altre bande, come osservato nel talamo, dove una banda di dimensioni di 16 kDa è stata osservata solo in tempi di esposizione più lunghi. La valutazione della sensibilità alla digestione PK è stata ottenuta misurando l'assorbimento di PrPSc prima e dopo il trattamento con proteinasi K, utilizzando il test IDEXX HerdChek BSE. Questa tecnologia si basa sulla cattura selettiva di PrPSc da parte di un polimero chimico specifico, attraverso interazioni poliioniche in presenza di PrPC da un campione omogeneo di cervello. I valori di assorbimento diminuiscono con le diluizioni in serie, quindi si può ritenere che la quantità di PrPSc sia direttamente proporzionale all'assorbimento. L'obiettivo di questo protocollo era di effettuare una quantificazione relativa di PrPSc senza trattamento con proteasi. Riteniamo che l'introduzione di una fase di digestione potrebbe essere utile per valutare facilmente la relativa resistenza alla digestione PK. I risultati hanno mostrato che i valori di assorbimento diminuiscono dopo il trattamento PK in tutti i campioni (Tabella). Per encefalopatia multi-infarto (MIE) e sCJD VV2, la rilevazione del segnale è stata ridotta del 4,32% e del 2,02%, rispettivamente, ma le riduzioni non sono state statisticamente significative. Al contrario, i campioni provenienti dal probando e da sCJD MM1 hanno mostrato una riduzione statisticamente significativa (p < 0,005) del segnale del 79,82% e del 22,68%, rispettivamente. I valori di assorbimento per MIE erano inferiori al cut-off, allo stesso livello dei controlli negativi. I valori restanti erano superiori al cut-off. Questi livelli differenziati di riduzione del segnale sono indicativi di tre livelli di resistenza alla digestione PK: alto, intermedio e basso. Un'alta resistenza alla digestione PK sarebbe rappresentata da una bassa percentuale di riduzione del segnale, come osservato per sCJD VV2. In questo caso, la riduzione del 2% del segnale indicherebbe che la digestione PK degraderebbe solo una minima frazione di PrPSc, suggerendo quindi un'alta resistenza della proteina prionica anomala. La resistenza intermedia sarebbe rappresentata da una percentuale leggermente superiore di riduzione del segnale, come osservato in sCJD MM1, in cui il 22% indicherebbe una frazione degradabile di PrPSc superiore a quella osservata nel caso precedente. Ciò rappresenterebbe un tipo di proteina solo leggermente sensibile alla degradazione con proteasi, a seconda della regione cerebrale. Sono in corso ulteriori indagini per chiarire se questo livello di degradazione sia associato al tipo di proteina MM1 o a un fenomeno specifico di questo soggetto. Infine, la bassa resistenza alla digestione PK sarebbe rappresentata da una percentuale elevata di riduzione del segnale, ad esempio il 79% osservato nel probando, indicando che una frazione elevata di PrPSc è degradabile. Ciò suggerisce l'esistenza di tipi di proteine prioniche anomale estremamente sensibili alla digestione proteasica che potrebbero potenzialmente essere trascurati dai metodi di rilevamento basati sulla caratteristica resistenza proteasica della proteina prionica patologica.