Un pastore tedesco maschio di 11 anni (GSD) è stato portato al pronto soccorso del Dipartimento di Scienze Cliniche degli Animali da Compagnia della Facoltà di Medicina Veterinaria dell'Università di Utrecht con una storia di 2 giorni di dispnea acuta e debolezza generalizzata. Vaccinazione e sverminazione erano state effettuate regolarmente. Il cane aveva visitato l'Europa meridionale 6 mesi prima della presentazione. Nessun farmaco era stato somministrato prima dello sviluppo dei segni clinici e non erano state segnalate circostanze ambientali che potessero causare dispnea (ad esempio, esposizione a tabacco, solvente organico, polvere). L'esame fisico ha mostrato un cane reattivo ma letargico con debolezza generalizzata, grave dispnea, mucose cianotiche, tempo di riempimento capillare prolungato, deboli impulsi periferici, tachicardia (frequenza cardiaca 180 battiti/min) e un grado uno su sei di rumore sistolico con il punto di massima intensità sul vertice cardiaco destro. Durante l'auscultazione polmonare sono stati ascoltati suoni polmonari aspri. L'emocromo completo (CBC) ha mostrato una lieve leucocitosi matura (globuli bianchi: 18,9 × 109/L; intervallo di riferimento 4,5–14,6 × 109/L) e un'ematocrito del 56% (intervallo di riferimento 42–61%). La biochimica non ha mostrato anomalie. L'analisi del sangue arterioso ha mostrato una grave ipossemia (PaO2: 48,5 mm Hg; intervallo di riferimento 85–103 mm Hg) e una lieve ipocapnia (PaCO2: 27,0 mm Hg; intervallo di riferimento: 32–43 mm Hg). La causa sospetta dell'ipocapnia era l'iperventilazione. Le concentrazioni di D-dimero e antitrombina erano entro gli intervalli di riferimento. L'esame delle feci (tecnica di isolamento larvale per galleggiamento e Baermann) e il test rapido per la filaria (SNAP® Heartworm RT Test, IDEXX Laboratories) sono stati entrambi negativi. Le radiografie toraciche mostravano una dilatazione del tronco dell'arteria polmonare e una cardiomegalia di destra. L'ecocardiografia era gravemente compromessa a causa dell'ansia e del respiro affannoso del cane e pertanto limitata. Mostrava una grave dilatazione ventricolare destra, una lieve dilatazione uniforme dell'arteria polmonare principale, un appiattimento sistolico del setto interventricolare e una moderata rigurgito tricuspide. L'applicazione dell'equazione di Bernoulli modificata alla velocità del getto di rigurgito tricuspide mostrava una pressione arteriosa polmonare sistolica stimata di 77 mm Hg, classificata come grave PH (riferimento < 25 mm, grave > 75 mm Hg) ([]). Le dimensioni del ventricolo sinistro erano notevolmente ridotte, coerentemente con un deplezione di volume del lato sinistro. Fu eseguita un'ecocardiografia con contrasto salino, che risultò negativa, escludendo così uno shunt intra- ed extra- cardiaco da destra a sinistra. Per affrontare la grave ipossemia e la PH il cane fu posto in una gabbia di ossigeno con una concentrazione inspirata di ossigeno compresa tra 40 e 50%. Inoltre, vennero somministrati 1,5 mg/kg/8 h di sildenafil orale (Viagra®, Pfizer, New York, USA) e 0,25 mg/kg/12 h di pimobendan orale (Vetmedin®, Boehringer Ingelheim, Germania). Questa terapia non influenzò significativamente le condizioni cliniche del cane. Tuttavia, l'ipossemia arteriosa migliorò leggermente dopo il primo giorno di terapia (PaO2 aumentata da 48,5 a 53 mm Hg, intervallo di riferimento 85–103 mm Hg). L'ecocardiogramma fu ripetuto il terzo giorno di terapia e i cambiamenti ecocardiografici e la gravità della PH si ridussero notevolmente. La dilatazione ventricolare destra era drammaticamente diminuita, il setto interventricolare non era più appiattito e il gradiente di pressione della rigurgito tricuspide era ridotto da 77 mm Hg a 41 mm Hg (intervallo di riferimento < 25 mm Hg). Pertanto, la terapia con pimobendan e sildenafil fu continuata durante il periodo di ospedalizzazione (7 giorni). Come ulteriori passaggi diagnostici, 4 giorni dopo la prima visita, sono state effettuate una TAC (pre-e post-contrasto) con apnea, seguita da una biopsia polmonare chirurgica nella stessa seduta anestetica. È stato utilizzato un tomografo computerizzato a singolo piano (Philips Secura, Philips NV, Eindhoven, Paesi Bassi). Le impostazioni tecniche includevano fette elicoidali da 3 mm, 120 kV, 200 mA, 292 mm di campo visivo, matrice da 512 × 512 e un algoritmo ad alta frequenza spaziale. Sulle immagini TAC, il parenchima polmonare mostrava sottili noduli di vetro smerigliato centrolobulari e un'arteria polmonare ingrossata. Le linee settali, il versamento pleurico e la linfoadenopatia erano assenti. I risultati della TAC erano compatibili con la PH senza una diagnosi conclusiva. Dopo la TAC, è stata effettuata una biopsia polmonare del lobo cranio-laterale sinistro (3 × 2 cm) per un esame istopatologico con una mini-toracotomia. Immediatamente dopo questa procedura, è stata iniziata una terapia con desametasone (0,25 mg/kg q24 h I.V., Rapidexon ®, Eurovet Animal Health, Bladel, Paesi Bassi) come ultima risorsa, mentre erano in attesa i risultati istopatologici (3 giorni). L'istopatologia della biopsia polmonare chirurgica ha mostrato una moderata polmonite interstiziale cronica istiocitaria di eziologia sconosciuta e atelettasia evidenziata da colorazioni con ematoxilina ed eosina, acido perossido di Schiff e Van Gieson. Inizialmente, i cambiamenti vascolari non erano chiaramente identificati. A causa della scarsa risposta al trattamento iniziato e del sospetto di una prognosi sfavorevole sulla base dei risultati istopatologici, il cane è stato soppresso. L'autopsia è stata eseguita con il consenso informato del proprietario. La patologia grossolana dei polmoni mostrava polmoni collassati moderatamente con un aspetto macchiato diffuso con più focolai rossi scuri di 1 × 1 × 3 mm e un piccolo numero di focolai bianchi di 1 × 1 × 1 mm, spesso circondati da una zona rossa scura (demarcazione) distribuita in modo casuale in tutti i lobi polmonari. La routine istopatologica dei polmoni mostrava un rimodellamento vascolare multifocale. Per distinguere tra piccole arterie e vene, essenziale per diagnosticare la PVOD, è stata aggiunta un'ulteriore macchia che visualizza le fibre elastiche e il collagene (Resorcin Fuchsin di Weigert) per identificare le lamine elastiche. In questo cane, come nelle persone con PVOD, tutti e tre i compartimenti (arterie, vene e capillari) del microcircolo polmonare erano colpiti, sebbene i cambiamenti nel sistema venoso polmonare fossero i più pronunciati. Le lesioni venulari includevano una grave proliferazione intima concentrica, l'obliterazione parziale o completa dei lumi e la ricanalizzazione post-trombotica. Le lesioni capillari erano organizzate in focolai, più evidenti adiacenti alle venule rimodellate e caratterizzate da proliferazione di cellule endoteliali piombate (simili a PCH). La congestione segmentale dei capillari alveolari era anche regolarmente associata ai focolai di PCH. Le lesioni arteriose somigliavano a quelle di PAH con ispessimento dell'intima concentrico per aumento della matrice extracellulare e ipertrofia mediale, ma erano assenti le complesse lesioni plessiformi. Questi risultati erano coerenti con quelli descritti da Williams et al. [] e quindi con l'equivalente umano della PVOD. Il DNA genomico del caso è stato isolato da sangue EDTA utilizzando un robot di estrazione Chemagen semi-automatizzato (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH) ed è stato conservato a − 20 °C. Circa 6 anni dopo, il DNA genomico del caso e quello di un GSD sano non correlato sono stati analizzati mediante sequenziamento dell'intero genoma. L'integrità del DNA è stata controllata su un Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, USA) e quantificata utilizzando Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Le librerie di DNA sono state preparate utilizzando il kit di preparazione librerie TruSeq Nano (kit di preparazione librerie TruSeq Nano, Illumina, San Diego CA, USA) utilizzando 200 ng di input di gDNA. Le informazioni di sequenziamento dell'intero genoma a copertura 30× sono state ottenute utilizzando uno strumento HiSeqX Ten (strumento HiSeqX Ten, Illumina, San Diego CA, USA) e 2 × 150 letture di estremità accoppiate. I dati sono stati elaborati con il nostro pipeline v1.2.1 () sviluppato internamente, che comprende l'analisi delle mutazioni somatiche (Strelka, VarScan, FreeBayes e MuTect) e un kit di strumenti per l'analisi del genoma (GATK v. 3.2.2) [] secondo le linee guida sulle best practice []. Le sequenze sono state mappate rispetto al Canine Reference Genome (CanFam 3.1) utilizzando l'allineamento Burrows-Wheeler con corrispondenza esatta massima (BWA-MEM) v0.7.5a [] seguito da rilevamento di duplicati, fusione di corsie e riallineamento di indelli. Non è stato effettuato alcun ricalibramento delle basi. In medicina umana, è stato suggerito che le mutazioni in BMPR2, ACVRL1, ENG, KCNK3, CAV-1 e SMAD9 sono responsabili di una forma autosomica dominante di PAH []. Questi geni sono stati inclusi nelle analisi per evitare la mancanza di mutazioni candidate a causa di una classificazione fenotipica errata. Confrontando il caso e il controllo, l'analisi di questi geni ha rivelato 196 varianti introniche uniche. Confrontando la sequenza di EIF2AK4 nel caso e quella del GSD sano, sono state rilevate 124 varianti uniche, di cui 9 erano situate nella 3'UTR, 112 erano varianti introniche e 3 erano esoniche. Il caso era un mutante omozigote per c.2961T>C e c.1266G>A, mentre è stata rilevata una variazione eterozigote in c.2092G>A. La validazione della variante è stata effettuata mediante sequenziamento Sanger su prodotti amplificati della reazione a catena della polimerasi da DNA genomico, utilizzando Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Dopo il trattamento con exonuclease I, sono state effettuate reazioni di sequenziamento DNA utilizzando BigDye v3.1, sequenziate su un ABI3130XL e analizzate in Lasergene (versione 12.0 DNASTAR). Quattro dei cinque GSD aggiuntivi, sconosciuti per qualsiasi forma di stress respiratorio e di età pari o superiore a 10 anni, hanno rivelato lo stesso genotipo del caso e sono stati quindi esclusi come varianti causali per la PVOD.