Un esemplare maschio di lontra eurasiatica di 4 anni nato nel 2015 nel “Sendaviva, Natural Park of Navarra” (42°11′31″N, 1°34′33”O) (nord-est della Spagna) è stato trasferito nel parco faunistico “Terra Natura” (sud-est della Spagna) nel 2017. Il parco faunistico “Terra Natura” si trova nei dintorni della città di Murcia (38°00′40″N, 1°09′54”O). Il recinto delle lontre consisteva in un’area con rifugi a libero accesso e un laghetto contenente 4 animali di questa specie (2 maschi e 2 femmine). Nessun insetticida anti-sandfly per via topica è stato applicato alle lontre. Nell’agosto 2019 l’animale ha presentato epistassi bilaterale, anoressia, apatia e perdita di peso. L’animale è stato sedato prima della manipolazione con medetomidina (0,2 mg/kg/i.m.) e ketamina (20 mg/kg/i.m.). Il sangue intero è stato prelevato per via venipuntura della vena cefaliche, drenato in un tubo da 1 ml rivestito con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e un tubo da 1 ml senza anticoagulante per un conteggio completo delle cellule del sangue (CBC) e analisi biochimiche, rispettivamente. Il CBC è stato eseguito in un contatore di cellule del sangue (ADVIA 120 Hematology System, Siemens, Italia), e le analisi biochimiche sono state eseguite in un analizzatore biochimico automatizzato (Olympus AU600 Automatic Chemistry Analyzer, Olympus Europe GmbH, Hamburg, Germania). Inoltre, è stata prelevata urina per un’analisi urologica. È stata eseguita un’ecografia del cuore e degli organi addominali, compresi rene, milza, fegato, cistifellea, pancreas e sistema digerente. Poiché i risultati biochimici ed ecografici erano compatibili con la leishmaniosi clinica, sono stati eseguiti test sierologici e molecolari per confermare la presenza dell’infezione. La presenza di anticorpi IgG2 anti-Leishmania è stata valutata nel siero della lontra mediante un saggio immunofluorescente risolto nel tempo (TR-IFMA) eseguito come descritto da Cantos-Barreda et al. []. Per verificare che il saggio TR-IFMA validato per il siero del cane potesse essere applicato al siero della lontra, è stata effettuata un'analisi Western blot. Il Western blot è stato eseguito in sieri di lontra con segni compatibili con la leishmaniosi e di un cane sieropositivo per le leishmaniosi mediante TR-IFMA. I sieri (diluizione 1:2000) sono stati separati in condizioni di riduzione su mini gel di poliacrilammide (0,1% di sodio dodecil solfato (SDS), 12% di gel di risoluzione e 4% di gel di accumulo). Le proteine risolte sono state trasferite elettroforeticamente su un foglio di nitrocellulosa (Bio-Rad, USA) e poste in un substrato ROTI®Lumin (Carl Roth, Germania) per il blocco per 2 ore a temperatura ambiente. L'anticorpo policlonale di pecora anti-IgG2 di cane (AHP498; Bio-Rad, USA) a diluizione 1:1000 è stato usato come anticorpo primario, mentre l'anticorpo di coniglio anti-IgG di pecora, coniugato con la perossidasi di rafano (HRP) (SAB3700702; Sigma-Aldrich, USA) a diluizione 1:1000 è stato usato come anticorpo secondario per rilevare l'anticorpo primario legato. Il rilevamento del segnale è stato effettuato utilizzando un kit Pierce ECL2 (Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA) ed è stato digitalizzato in uno scanner Typhoon 9410 (GE Healthcare, USA). Una banda di circa 150 kDa è stata osservata nel campione di lontra e nel campione di cane (vedi figura e file supplementare). Questi risultati hanno confermato che il saggio TR-IFMA che utilizza anticorpi anti-IgG2 di pecora era in grado di rilevare l'IgG2 della lontra. Il saggio TR-IFMA consisteva in un metodo indiretto non competitivo basato su un antigene ricombinante biotinilato K39 come reagente di cattura e anticorpo policlonale anti-IgG2 di pecora (anticorpo anti-pecora, Bio-Rad, USA) Eu3 +-labellato come rivelatore. Il test includeva siero da un cane Leishmania sieropositivo come controllo positivo e siero da un cane Leishmania sieronegativo come controllo negativo. L'analisi è stata effettuata in un contatore multi-label (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finlandia). I risultati sono stati espressi come unità di fluorometria per le leishmania (UFL). Il cut-off è stato fissato a 22 UFL. È stato anche effettuato un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Spagna) per rilevare specifici anticorpi IgG contro le leishmania. I sieri sono stati diluiti 1:20 e i risultati sono stati espressi come rapporto campione/positivo (S/P), calcolato in base alla densità ottica (OD) del campione/OD del basso positivo. Valori di S/P superiori a 1,1 sono state considerate positive. La presenza di DNA di Leishmania spp. nel sangue intero e nel midollo osseo è stata valutata mediante amplificazione della sequenza di DNA del kinetoplast di Leishmania spp. utilizzando una rtPCR con primer e sonde precedentemente descritte []. Il midollo osseo è stato prelevato mediante aspirazione con ago sottile dall'unione costo-condrale e drenato in un tubo da 1 ml rivestito con EDTA. Il DNA è stato estratto utilizzando il kit di preparazione del campione per PCR ad alta purezza (Roche, Germania), seguendo le istruzioni del produttore. La rtPCR è stata eseguita in un volume finale di 20 μl, comprendente 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, U.S.A.), 900 nM di ciascun primer, 200 nM di sonda TaqMan, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA e 50 ng di DNA da ciascun campione. I parametri di ciclizzazione sono stati: 50 °C per 30 s, 95 °C per 10 min, 45 cicli a 94 °C per 30 s e 55 °C per 1 min. Ogni ciclo di amplificazione comprendeva controlli positivi e negativi e ogni misurazione è stata effettuata in triplicato. Per l'identificazione della specie Leishmania, i prodotti della PCR provenienti dai campioni positivi sono stati purificati utilizzando il kit di purificazione del prodotto della PCR ad alta purezza (Roche, Germania) e sottoposti a sequenziamento presso la sezione di biologia molecolare dell'Università di Murcia. Le sequenze ottenute sono state confrontate con quelle disponibili in GenBank. Inoltre, come controllo negativo, le stesse analisi sono state effettuate su una lontra eurasiatica femmina di 3 anni proveniente dallo stesso parco naturale, senza segni clinici compatibili con la leishmaniosi. Tutti i risultati sono stati riportati in una tabella. La presenza di leishmaniosi è stata confermata e è stato somministrato un trattamento specifico (allopurinolo 15 mg/kg/24 h/p.o.). Il monitoraggio del trattamento è stato effettuato a novembre 2019, dopo 3 mesi di trattamento. Sono state osservate nefropatie bilaterali con idronefrosi, linfadenomegalia mesenterica e ascite. La conta ematica ha rivelato una diminuzione dei globuli bianchi e delle piastrine nella lontra positiva per leishmania. Il profilo biochimico del siero della lontra positiva per leishmania ha mostrato iperproteinaemia, iperglobulinemia, diminuzioni di PON-1 e aumenti di aptoglobina e ferritina. L'analisi delle urine ha rivelato proteinuria e diminuzioni dell'osmolarità e del peso specifico. La presenza di anticorpi IgG2 anti-leishmania e un risultato positivo mediante RT-PCR nel sangue intero e nel midollo osseo sono stati osservati nella lontra positiva per leishmania. Il sequenziamento dei campioni positivi ha confermato l'identificazione di L. infantum. La sequenza amplificata ha mostrato una somiglianza del 100% con una sequenza di riferimento di L. infantum. Inoltre, nella citologia della milza sono stati osservati microrganismi ovali con un nucleo eccentrico compatibile con gli amastigoti di Leishmania spp. (Fig.