Una paziente di 52 anni con storia di colecistectomia e resezione parziale del lobo sinistro del fegato nel 2004 a causa di calcoli biliari sintomatici e metastasi multiple intraepatiche del dotto biliare, aveva febbre intermittente e ittero progressivo dall'inizio di novembre 2014. L'ostruzione del dotto biliare e un sospetto di neoplasia epatica erano stati rilevati tramite successiva ecografia, risonanza magnetica colangiopancreatografica (MRC), risonanza magnetica, e tomografia a emissione di positroni-tomografia computerizzata (PET-CT). Alla fine di novembre 2014 è stata eseguita una laparotomia esplorativa (file aggiuntivo: figura S1) e sono state riscontrate gravi adesioni intra-addominali, un nodulo (1 × 2 cm) con consistenza indurita nel dotto epatico sinistro prossimale e metastasi multiple intraepatiche del dotto biliare, del legamento epatoduodenale, dei linfonodi circostanti, dell'arteria epatica, della vena porta e dell'asse celiaco. Questi risultati hanno costretto i chirurghi ad abbandonare la resezione radicale. Bile purulenta è stata scaricata dal dotto comune e un tappo di muco è spuntato dalla parete del dotto biliare. Le metastasi neoplastiche parziali sono state rimosse dai linfonodi ingranditi, dal nodo del dotto epatico sinistro e dal margine del dotto epatico comune per esame patologico. Il drenaggio del dotto T è stato installato per alleviare l'ostruzione biliare. I rapporti patologici hanno rivelato che la natura del tumore era un adenocarcinoma scarsamente differenziato con marcatori di differenziazione dei colangiociti; inoltre, è stata rilevata un'espressione moderata di EGFR in >90% delle cellule tumorali. Alla fine questa paziente è stata diagnosticata come CCA perihilar avanzato non operabile. Cinque settimane dopo la chirurgia palliativa, la paziente ha ricevuto un ciclo di 4 settimane di terapia con TOMO sul nodo maligno epatico (DT = 60 Gy/25 F), un ciclo di chemioterapia sistematica con paclitaxel legato all'albumina da sola per le sue intollerabili tossicità gastrointestinali e l'infusione di cellule killer indotte da citochine autologhe. A causa dell'aumento progressivo di CA199, la PET-CT è stata riesaminata immediatamente dopo il completamento della radioterapia e ha mostrato una nuova lesione ipermetabolica metastatica nel lobo caudato del fegato e metastasi ingrossate dei tessuti molli e linfonodi retroperitoneali con anormale valore di assorbimento standardizzato (SUV) tra il fegato e lo stomaco rispetto alla PET-CT prima della radioterapia. Quattro settimane dopo la radioterapia, la paziente è stata arruolata nello studio CART-EGFR. Il suo performance status era 1 secondo i criteri dell'Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Durante la preparazione delle cellule CART-EGFR, ha sviluppato febbre alta, ittero aggressivo e ostruzione del dotto biliare, accompagnata da elevazione continua di CA199 (da 100,5 a 413,5 U/ml), aumento aggressivo della bilirubina totale, della bilirubina diretta e di altri indici di ostruzione biliare correlati, ed è stata trattata con antibiotici ad ampio spettro ed endoscopia con stent biliare nei dotti epatici. Le sperimentazioni (identificatore ClinicalTrials.gov NCT01869166, NCT02541370) sono state approvate dall'Institutional Review Board del Chinese PLA General Hospital. Nessuno sponsor commerciale è stato coinvolto negli studi. I pazienti arruolati hanno fornito il consenso informato scritto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. La sequenza di DNA del frammento variabile a catena singola (scFv) che si rivolge all'antigene EGFR è stata derivata da JQ306330.1 (Numero GenBank). L'anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta CAR è stato generato e clonato nel backbone lentivirale pWPT, come descritto in dettaglio da Feng et al. []. La costruzione è stata verificata mediante sequenziamento del DNA. Un supernatante di vettore lentivirale pseudotipato di grado clinico è stato prodotto mediante una trasfezione transiente standard come descritto da McGinley et al. [ ] Secondo le istruzioni del produttore del reagente di trasfezione Lipofectamine 3000 (Invitrogen, USA), il plasmide pWPT-anti-EGFR CAR, il plasmide di pacchettizzazione ps-PAX2 e il plasmide di busta pMD2.G sono stati trasfettati in cellule 293 T. I supernatanti lentivirali sono stati raccolti e conservati a -80 °C. Il vettore GFP-CD137-CD3zeta è stato costruito per verificare l'efficienza della trasduzione mediante citometria a flusso FACSCalibur (BD Biosciences). La sequenza di DNA di scFv che si rivolge all'antigene CD133 è stata derivata da HW350341.1 (Numero GenBank), la generazione, la costruzione e il test delle cellule CART-EGFR hanno seguito la stessa procedura delle cellule CART-EGFR (File supplementare: Figura S2). Le cellule CART sono state prodotte da cellule mononucleari di sangue periferico autologhe (PBMC) raccolte in provette per la preparazione di cellule (BD Biosciences, San Jose, CA) purificate da 80 a 100 ml di sangue intero presso il Chinese PLA General Hospital Good Manufacturing Practice Facility secondo le procedure operative standard in vigore. Le PBMC sono state stimolate con 50 ng/ml di anti-CD3 MoAb (Takara, Giappone) e 500 U/ml di interleuchina-2 umana ricombinante (Peprotech, USA) in GT-T551 medium (Takara). La trasduzione lentivirale è stata effettuata in GT-T551 medium con protamina solfato (Sigma) per 24 ore dopo 2 giorni di coltura di cellule T. Successivamente, le cellule sono state ulteriormente espanse in sacche di coltura (Takara) e raccolte come cellule CART. Bacteria, funghi ed endotossine sono stati testati prima dell'infusione di cellule CART. L'immunofenotipo delle cellule CART è stato analizzato mediante citometria a flusso con anticorpi fluorescenti specifici per la colorazione di CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L e CCR7. Per la colorazione di controllo sono stati utilizzati anticorpi monoclonali isotipici (BD Biosciences). L'espressione di CAR è stata stimata sulla base di cellule transdotte con GFP-CD137-CD3zeta nello stesso lotto per tutti i pazienti mediante citometria a flusso. L'acquisizione e l'analisi dei dati sono state effettuate utilizzando una citometria a flusso FACSCalibur (BD Biosciences). La citotossicità in vitro delle cellule CART-EGFR è stata testata mediante co-coltura con cellule tumorali positive per EGFR a vari rapporti tra effector e target in piastre da 96 pozzetti utilizzando un kit di rilevamento CCK-8 da 4 ore (DOJINDO, Giappone). La PCR quantitativa in tempo reale (Q-PCR) è stata impiegata per valutare il livello di fusione del gene CAR secondo un protocollo precedentemente descritto.13 Un frammento di 153 bp (parete di base) che contiene porzioni della catena CD8a e della catena 4-1BB adiacente (il primer diretto 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ e il reverse primer 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) è stato amplificato dal sistema di rilevamento della sequenza ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). La beta-actina è stata utilizzata come controllo interno. È stata preparata una curva standard a 7 punti che consisteva da 100 a 108 copie/μl di DNA plasmidico contenente il gene CAR. Il siero di IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF e Granzyme B sono stati testati utilizzando un immuno-saggio a sandwich con microperle BD Biosciences secondo le istruzioni del produttore. Secondo il sistema di coltura come riportato in precedenza [], le cellule CART-EGFR sono state generate dalle cellule mononucleari di 80-100 ml di sangue periferico del paziente e rilasciate per le infusioni. Delle cellule infuse durante il primo ciclo di terapia CART-EGFR, il 99,14% erano cellule CD3+ composte principalmente dal sottogruppo CD8+ (62,26%), e il 23,61% erano caratterizzate dal fenotipo di memoria centrale (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Inoltre, l'8,99% delle cellule infuse erano positive per EGFR. Il fenotipo e l'efficienza di trasfusione delle cellule CART-EGFR infuse in ogni ciclo sono documentati nella Tabella. Le cellule CART133 sono state generate e coltivate secondo la stessa procedura delle cellule CART-EGFR. Delle cellule infuse, il 95,2% erano cellule CD3+ composte principalmente dal sottogruppo CD8+ (71,9%), e il 41,9% erano cellule CD45RO+/CD62L+/CCR7+. Inoltre, il 6,4% delle cellule infuse erano cellule CD133 positive. I dettagli sono documentati nella Tabella. A causa della radioterapia recentemente completata entro 2 mesi e dell'intolleranza agli agenti chemioterapici, alla paziente sono state somministrate infusioni di 2,2 × 106/kg di cellule CART-EGFR in totale, senza alcuna terapia di condizionamento, e ha ottenuto una PR nella sua prima valutazione 6 settimane più tardi, valutata secondo i criteri RECIST 1.1 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) con MRI e PET-CT, che ha mostrato una riduzione di oltre l'80% delle lesioni metastatiche nella regione epato-iliaca e nel lobo caudato e una notevole diminuzione del SUV, insieme a una rapida diminuzione di CA199 da 413,5 a 123,1 U/ml. Il numero di copie del transgene CAR nel sangue periferico della paziente ha raggiunto un picco di 5916 pg/dl al giorno 9, accompagnato dal rilascio di citochine come interleuchina-6 (IL-6) e proteina C reattiva (CRP). Il secondo ciclo di monoterapia CART-EGFR è stato somministrato con una dose di cellule T che esprimono EGFR-CAR+ di 2,1 × 106/kg e senza alcun trattamento di condizionamento, poiché il numero di copie del transgene CAR nel sangue periferico è diminuito fino al livello basale 2 mesi dopo la prima infusione di cellule T geneticamente modificate che esprimono CART-EGFR. Gli esami di routine di MRI e PET-CT hanno mostrato una persistente PR accompagnata da una ulteriore riduzione di CA199 a 61,2 U/ml. È interessante notare che il picco del numero di copie del transgene CAR dopo la seconda infusione di cellule CART-EGFR non ha raggiunto un livello parallelo o superiore a quello del primo ciclo di terapia CART-EGFR. Lo stato PR della paziente è stato mantenuto per 8,5 mesi fino a quando non ha sviluppato frequenti vomiti non gestibili, dolori addominali superiori e reflusso gastrico, che si sono verificati a metà novembre 2015. La successiva gastroscopia elettronica ha mostrato una stenosi del bulbo duodenale e la PET-CT ha confermato la progressione del tumore con illustrazione di molte nuove anomalie SUV nella regione omento maggiore, nel peritoneo e nella cavità addominale. Successivamente, il paziente è stato trattato con 1 ciclo di terapia CART-EGFR combinato con 2 cicli di anticorpo monoclonale anti-proteina 1 della morte cellulare programmata (PD-1) (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), somministrato a una dose di 100 mg ogni 2 settimane. Allo stesso modo, il numero di copie del transgene CAR monitorato nel sangue periferico non ha raggiunto un livello di picco simile alla prima infusione del ciclo, nemmeno in combinazione con anticorpo anti-PD-1. Nonostante il CA199 nel siero sia diminuito temporaneamente da 326,3 a 210,8 U/ml, la successiva PET-CT ha rilevato nuove metastasi emerse nella parte inferiore del bacino, nel lobo destro del fegato e nel linfonodo sovraclavicolare sinistro, nonché un ingrandimento delle precedenti lesioni tumorali nell'addome rispetto alla PET-CT prima della immunoterapia combinata. Poiché oltre il 90% delle cellule tumorali esprimeva la proteina CD133 (file supplementare: figura S3), la paziente è stata poi arruolata nello studio CART133 e ha ricevuto l'infusione di 1,22 × 106/kg di cellule CART specifiche per CD133 senza trattamento di condizionamento. A causa dell'ostruzione del duodeno discendente e della conseguente infezione persistente delle vie biliari, nonché dell'ascesso epatico, che possono interferire con il livello di CA199 sierico e sono stati trattati con antibiotici, la pianificata valutazione di imaging è stata posticipata a 2 mesi dopo l'infusione di cellule CART133, in cui la TAC con mezzo di contrasto ha mostrato una notevole riduzione o addirittura la scomparsa di alcune metastasi nel peritoneo e nella cavità addominale, portando a una valutazione di PR. Il numero di copie del transgene CAR nel sangue periferico (PB) è variato da 377 a 919 pg/dl. La paziente ha sentito un dolore sordo persistente nella parte superiore dell'addome 2,5 mesi dopo, e la successiva TAC ha rilevato una nuova lesione metastatica di circa 40 × 70 mm sotto la parete addominale e sospette metastasi nella cavità addominale accompagnate da un numero di copie del transgene CAR nel PB in diminuzione vicino al livello basale, portando a una conclusione di malattia progressiva (PD). Gli eventi avversi come brividi, febbre, affaticamento, vomito e dolori muscolari verificatisi durante l'infusione di cellule CART-EGFR erano solitamente lievi, tollerabili e gestibili con le cure di supporto. Tuttavia, il paziente ha sviluppato una febbre più bassa che durava 9 giorni senza brividi, tosse, diarrea o altri sintomi infettivi dal terzo giorno successivo all'infusione di cellule CART. Un ripetuto esame di laboratorio del PB ha mostrato un normale numero di globuli bianchi, rapporto neutrofili, procalcitonina negativa (PCT) e colture di sangue, che non supportavano la diagnosi di infezione, ma nel frattempo un'escalation di IL-6 e CRP e un acuto aumento della glutamico-piruvico transaminasi e glutamico-ossalacetica (>6ULN). Ci sono state alcune eruzioni cutanee sparse che sono apparse nella coscia sinistra due settimane dopo la prima infusione di cellule CART-EGFR, che sono gradualmente peggiorate e sono diventate evidenti e pruriginose con la comparsa di molte eruzioni squamose o lineari che si sono diffuse dalla coscia sinistra al polpaccio e si sono unite, che è stata classificata 2 secondo i criteri di terminologia comune per gli eventi avversi 4.0 (CTCAE 4.0), quando è stato completato il secondo ciclo di immunoterapia CART. Le eruzioni sono state sottoposte a biopsia con illustrazione di cambiamenti patologici simili al lichen striatus come la perdita di epidermide parziale, degenerazione vacuolare delle cellule basali e infiltrazione di numerosi linfociti T nell'epidermide e nei suoi appendici, e sono state gestite con successo con un unguento a base di tacrolimus. Non si è verificata ipotensione durante il trattamento CART-EGFR. A parte lievi nausee, vomito, brividi, febbre e stanchezza, non si sono verificati altri eventi avversi acuti nel corso del trattamento combinato. Sebbene la forfora sia apparsa e peggiorata a seguito dell'immunoterapia combinata, non è stato necessario intervenire con farmaci. I livelli sierici di citochine come il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), IL-6 e CRP sono aumentati leggermente e non hanno indotto alcun sintomo di rilascio di citochine. Durante l'infusione di cellule CART133 in dosi crescenti nell'arco di 4 giorni, non si sono verificati altri eventi avversi, ad eccezione di una lieve febbre e stanchezza legate all'infusione. Tuttavia, la mattina successiva al completamento dell'infusione di cellule CART133, questa paziente ha sviluppato un dolore sordo intermittente nella parte superiore dell'addome, brividi, febbre (39,1 °C), sporadiche emorragie puntiformi e eruzioni cutanee congestizie sui polpacci, che si sono diffuse rapidamente e diffusamente al collo, al braccio superiore destro, al torace, all'addome sinistro e alla mucosa retrofaringea, accompagnate da prurito e diarrea nel pomeriggio, e sono ulteriormente peggiorate nei 10 giorni successivi e il ligando 1 della proteina di morte cellulare programmata (PD-L1) [,], con conseguente rapida perdita della loro capacità di citolisi e secrezione di citochine e l'ingresso in uno stato di iporesponsività []. Inoltre, i tumori solidi dimostrano spesso aberrazioni metaboliche, consumando in eccesso aminoacidi essenziali critici per l'attività delle cellule T e inducendo ipossia e conseguente acidificazione della matrice extracellulare a causa di un insufficiente apporto vascolare ostile alla sopravvivenza delle cellule T []. Pertanto, la modulazione del microambiente tumorale è necessaria per migliorare i risultati. In questo caso, nonostante il fatto che la paziente non abbia ricevuto alcun trattamento di condizionamento diretto con lo scopo di trasformare il microambiente tumorale, è stata trattata con radioterapia a 60 Gy prima dell'immunoterapia con un intervallo di circa 1 mese tra la fine della radioterapia e l'inizio dell'infusione di cellule CART. Sebbene la radioterapia stessa non sia riuscita a eradicare efficacemente le cellule tumorali, il suo effetto diretto e ritardato può svolgere un ruolo nella distruzione del microambiente del tumore, alterando la biologia del microambiente del tumore, promuovendo il rilascio di più antigeni associati al tumore e migliorando il riconoscimento immunitario []. Inoltre, la radioterapia potrebbe rendere i tumori più immunogenici e più suscettibili a un attacco migliorato da parte delle cellule immunitarie [], e persino generare effetti antitumorali in quelle metastasi distanti che non sono state irradiate localmente (chiamate effetto abscopale) [, ]. Pertanto, abbiamo proposto l'ipotesi che la radioterapia potesse essere una terapia di condizionamento ragionevole ed efficace per migliorare l'esito della terapia CART. Quando la resistenza alla terapia CART-EGFR fu confermata, provammo una volta una combinazione immunoterapia con anticorpo anti-PD-1 in congiunzione con infusione di cellule CART-EGFR sulla base di uno studio preclinico che dimostrò che il blocco dell'immunosoppressione PD-1 poteva migliorare significativamente l'efficacia terapeutica della terapia con cellule CART contro tumori solidi stabiliti []. Purtroppo, questo trattamento si è concluso con un fallimento, con una PET-CT che ha verificato la progressione della malattia, nonostante il CA199 fosse diminuito in modo transitorio. Una possibile spiegazione è il livello non chiaro di espressione di PD-L1. Recentemente, l'espressione di PD-L1 è stata evidenziata per il suo valore nella predizione degli effetti terapeutici dei farmaci anti-PD-1. Tuttavia, la lesione tumorale in questo caso era difficile da biopsare per la sua posizione anatomica, di conseguenza il livello di espressione della proteina PD-L1 sulle cellule tumorali non poteva essere rilevato con precisione prima dell'inizio della terapia anti-PD-1, il che ha comportato la possibilità che l'espressione di PD-L1 nel tumore fosse a livello basso o addirittura negativo e quindi ha portato al fallimento del trattamento anti-PD-1. Nel frattempo, c'erano molte altre vie di controllo dei checkpoint parallele che potevano potenzialmente supportare la resistenza alla terapia anti-PD-1 [] In questa situazione, la selezione di un target razionale è stata fondamentale per la fase successiva del trattamento dei pazienti. Recentemente, le CSC in CCA hanno attirato grande attenzione per le loro proprietà altamente cancerogene e ruoli chiave nel mediare il rinnovamento, la ricrescita del tumore e la resistenza terapeutica, di conseguenza, la terapia che ha come target i marcatori molecolari di superficie e le vie di segnalazione specifiche per le CSC potrebbe essere una possibile opzione potente per il CCA [, ]. Tra le molecole utilizzate individualmente o in combinazione per identificare le cellule staminali del colangiocarcinoma, CD133 è uno dei più importanti marcatori delle cellule staminali che sono associate a maggiore invasività e prognosi peggiore [] Shien e colleghi hanno anche riferito che le cellule tumorali CD133-positive hanno mostrato una maggiore resistenza al trattamento post-operatorio rispetto alle cellule CD133 negative, e un aumento dell'espressione di CD133 è stato osservato nelle cellule tumorali residue dopo la terapia adiuvante [] Sulla base di quanto detto, abbiamo infine selezionato CD133 come target antigenico per l'immunoterapia CART, che a sua volta ha prodotto un'altra risposta parziale, e ha dimostrato ulteriormente che l'immunoterapia CART cocktail può essere fattibile e razionale. Un altro problema di grande importanza era la tossicità, che poteva essere indotta dalle cellule CART sui target antigenici espressi sulle cellule tumorali e/o in modo sincrono sui tessuti normali, definiti come effetto off-target sui tessuti normali. Il danno ai tessuti normali poteva verificarsi anche a causa di una reazione crociata inaspettata con una proteina che non era espressa sulle cellule tumorali []. Dall'inizio dell'infusione di cellule CART-EGFR, questo paziente ha manifestato non solo febbre, brividi e affaticamento correlati all'infusione, ma anche una persistente piressia, un'elevazione acuta delle transaminasi sieriche e un ritardo nell'insorgenza di eruzioni cutanee, accompagnati da un'elevazione robusta del numero di copie del transgene CAR, dell'IL-6 e della CRP, anche se i livelli non soddisfacevano i criteri per la diagnosi di sindrome da rilascio di citochine [, ]. Le citochine prodotte in modo massiccio dalle cellule CART infuse riflettevano una forte risposta immunitaria che poteva generare sia effetti antitumorali sulle cellule tumorali che effetti collaterali sui tessuti normali. Inoltre, l'effetto off-target sui tessuti normali causato dalle cellule CART-EGFR era probabilmente il motivo dell'insorgenza di tossicità dermatologiche, orali e gastrointestinali, come eruzioni cutanee e emorragie. Tuttavia, tutti questi eventi avversi erano lievi, reversibili e gestibili con un trattamento di supporto e corticosteroidi topici. L'aggiunta di anticorpi anti-PD-1 non sembrava aggravare le tossicità dell'immunoterapia CART-EGFR in questo caso. Tuttavia, nel successivo trattamento con infusione di cellule CART133, questo paziente ha sofferto di gravi tossicità dermatologiche, orali, mucose e gastrointestinali, come eruzioni cutanee e sanguinamento. Sebbene queste tossicità siano state gestite con successo mediante interventi medici d'emergenza, tra cui metilprednisolone per via endovenosa e inibitori anti-TNF, il meccanismo intrinseco può essere dovuto in gran parte all'effetto off-target sui tessuti normali delle cellule CART133, che hanno come target l'antigene CD133 espresso sull'epitelio normale e sull'endotelio vascolare. Nel frattempo, non era chiaro se gli anticorpi anti-PD-1 e le cellule CART-EGFR residue in vivo potessero svolgere un ruolo nel peggioramento delle tossicità dell'immunoterapia CART133.