Si trattava di un uomo di 22 anni affetto da B-ALL che aveva avuto una ricaduta di BM prima dell'iscrizione al nostro protocollo clinico compassionevole utilizzando cellule TanCAR-T 19. Gli era stata diagnosticata una B-ALL con più di 100 × 109/L di WBC e cariotipo normale a gennaio 2016. Dopo la remissione completa (CR) 2, era stato sottoposto a un haplo-HSCT dal padre 10 mesi dopo la diagnosi iniziale. Aveva sofferto di cistite emorragica e GVHD acuta gastrointestinale di stadio 1 entro 2 mesi dopo l'aplo-HSCT, che si era risolta con 15 dosi giornaliere di metilprednisolone 50 mg seguite da 5 dosi giornaliere di metilprednisolone 100 mg. Tre mesi dopo la sospensione della ciclosporina A e del metilprednisolone, la sua malattia era ricomparsa con 6,4% di blasti midollari quando aveva ancora un chimerismo completo del donatore, quindi era progredita rapidamente con 56,5% di blasti midollari mediante citometria a flusso 10,6 mesi dopo l'aplo-HSCT, e un chimerismo completo del donatore era stato documentato contemporaneamente. Aveva ricevuto chemioterapia di salvataggio con MOEP (3 dosi giornaliere di mitoxantrone 10 mg, vindesina 4 mg, 3 dosi giornaliere di etoposide 100 mg e 5 dosi giornaliere di desametasone 15 mg) e aveva una grave depressione midollare e nessuna risposta con 65,4% di blasti midollari 1 mese dopo il primo ciclo di MOEP. Quindi, era stato trattato con il protocollo di cellule aplo-CAR-T 19. Aveva ricevuto chemioterapia di riduzione con vindesina e metilprednisolone più idrossiurea e linfo-deplezione con daunorubicina e ciclofosfamide, e i suoi blasti midollari erano scesi a 12,7% prima dell'infusione di cellule aplo-CAR-T 19. Le cellule aplo-CAR-T 19 a una dose di 4,91 × 106/kg (2,89 × 107 T cells/kg, 17% di efficienza di trasfusione) erano state somministrate e avevano indotto MRD-CR (MRD-CR) e chimerismo completo del donatore entro 2 settimane dopo l'infusione. Le cellule aplo-CAR-T 19 infuse avevano mostrato una rapida espansione e avevano raggiunto un picco di 15.281 copie per microgrammo di DNA entro i primi 2 giorni dopo l'infusione, ma erano scese da 3374 copie per microgrammo di DNA al giorno 7 a 468 copie per microgrammo di DNA al giorno 12; metilprednisolone 160 mg e desametasone 5 mg erano stati usati il giorno 11 per il trattamento della sindrome da rilascio di citochine di grado 3 (CRS). Aveva sperimentato GVHD acuta cutanea di grado 3 entro 1 mese dopo l'infusione di cellule aplo-CAR-T 19, che era stata controllata con 5 dosi giornaliere di metilprednisolone 40 mg più ciclosporina A 80 mg somministrata dal giorno 31 dopo l'infusione di cellule aplo-CAR-T 19. Tuttavia, 1 mese dopo aver ottenuto MRD-CR, la sua malattia aveva mostrato una florida progressione con un aumento del numero di WBC da 1,59 × 109 a 12,52 × 109/L e la corrispondente percentuale di blasts circolanti da 1,39 a 67,37% entro 2 settimane; il suo midollo osseo mostrava una proliferazione cellulare altamente attiva con 59,67% di blasts che avevano il pattern di espressione CD19+ CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD58+ CD33- CD20- CD13- CD15-. Allo stesso tempo, erano stati documentati cellule aplo-CAR-T 19 non rilevabili e chimerismo del donatore. In questo caso, altre terapie tra cui TanCAR-T 19/22 piuttosto che la chemioterapia di salvataggio o la reinfusione di CAR-T 19 potrebbero essere un'opzione di trattamento potenziale per questo paziente a causa della scarsa risposta alla chemioterapia di salvataggio e della scarsa persistenza delle cellule CAR-T 19 infuse. Tuttavia, un carico tumorale maggiore e un intervallo a breve termine dopo la sospensione degli steroidi aumentavano notevolmente il rischio di fallimento della generazione di cellule CAR-T autologhe; la progressione florida della malattia rendeva meno fattibile l'attesa fino a quando gli steroidi non si fossero assottigliati. La terapia con cellule TanCAR-T 19/22 derivate da donatore rappresentava un approccio ottimale per superare questo problema, ma, come è noto, le terapie con cellule CAR-T aplo-DNA non dovevano essere raccomandate di routine nel caso di precedenti GVHD che richiedessero steroidi, principalmente a causa della maggiore preoccupazione per l'alto rischio di riattivazione della GVHD. Dopo un'attenta considerazione dei benefici clinici e dei rischi della seconda infusione di cellule aplo-CAR-T, è stato iscritto al nostro protocollo clinico compassionevole utilizzando cellule aplo-TanCAR-T 19/22. Suo padre è stato sottoposto ad aferesi e le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state utilizzate per preparare le cellule TanCAR-T 19/22. Ha ricevuto la chemioterapia citoriduttiva con vindesina 4 mg e cinque dosi giornaliere di metilprednisolone 80 mg e tre dosi giornaliere di idrossiurea 3 g seguite da una chemioterapia linfodeplettiva con idarubicina a una dose totale di 30 mg e ciclofosfamide a una dose totale di 3 g. L'aspirazione del midollo osseo pianificata dopo la chemioterapia e prima dell'infusione di cellule aplo-TanCAR-T 19/22 non è stata effettuata a causa della scarsa compliance del paziente. Due giorni dopo, è stato trattato con cellule aplo-TanCAR-T 19/22 a una dose totale di 4,72 × 106 cellule TanCAR-T 19/22 per chilogrammo (3,05 × 107 cellule T per chilogrammo, 15% di efficienza di trasfusione) somministrate tramite somministrazione frazionata (D0, 30%; D1, 70%) per motivi di sicurezza. I materiali e i metodi utilizzati nella produzione di TanCAR-T 19/22 sono stati descritti in precedenza [–], ad eccezione della costruzione del CAR e della fonte di PBMC utilizzate per la produzione delle cellule TanCAR-T 19/22. TanCAR-19/22 era una molecola CAR tandem, composta da un anti-CD22 scFv derivato dall'mAb m971 del topo [] e da un anti-CD19 scFv derivato dall'mAb FMC63 del topo [], uniti in tandem, cerniera CD8α umana e dominio transmembrana, e domini di segnalazione CD137 e CD3z umani. Uno schema di TanCAR-19/22 è mostrato nella figura a. Le PBMC utilizzate per la produzione delle cellule TanCAR-T 19/22 sono state raccolte mediante leucaferesi anziché sangue periferico fresco (PB). La citometria a flusso è stata utilizzata per la determinazione dell'efficienza di trasfezione di TanCAR-19/22 e la quantificazione delle cellule haplo-TanCAR-T 19/22 in campioni clinici, utilizzando un anticorpo specifico per il frammento F (ab') 2 di IgG di capra anti-topo biotinilato-SP-AffiniPure (Jackson ImmunoResearch, USA) e un anticorpo PE Streptavidin (BD Biosciences, USA). Le cellule haplo-TanCAR-T 19/22 in campioni clinici sono state misurate anche mediante qPCR come descritto []. L'entità del trapianto di donatori nei campioni clinici è stata valutata utilizzando l'amplificazione di brevi ripetizioni in tandem e la PCR multiplex con marcatura a fluorescenza, combinate con l'elettroforesi capillare, come descritto []. I livelli di interleuchina sierica (IL)-2, IL-6, IL-8 e IL-10 e del fattore di necrosi tumorale alfa sono stati analizzati in serie come descritto []. Il BM prima del protocollo di cellule haplo-TanCAR-T 19/22 mostrava una predominanza di cellule blastoidi con assenza di precursori del BM normali. La citometria di flusso del BM al giorno 14 dopo infusione di cellule haplo-TanCAR-T 19/22 indicava la presenza di 0,73% di blastoidi residui. Da notare che questi blastoidi leucemici residui mostravano il pattern di espressione CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD33+ CD19− CD20−, che non era rilevato dalla citometria di flusso al giorno 28 in assenza di ulteriore terapia. Dato il recupero incompleto di piastrine e neutrofili assoluti al giorno 28, questo paziente ha ottenuto una MRD-CRi al giorno 28 dopo infusione. Non c'era evidenza di blastoidi nel BM, né tramite striscio di BM né tramite citometria di flusso, in successivi momenti temporali per 14 mesi. Il BM ha mostrato una ricostituzione della normale emopoiesi al giorno 56, con l'eccezione della conta piastrinica, che non si era ancora ripresa a un livello di 36 × 109/L al momento della stesura di questo rapporto. Il chimerismo completo del donatore è stato stabilito al giorno 14 dopo infusione e è rimasto stabile in seguito. Dopo l'infusione, le cellule haplo-TanCAR-T 19/22 si sono espanse e hanno raggiunto un livello di picco del 30,7% delle cellule T circolanti al giorno 12, seguito da una fase di contrazione con un livello basso del 0,45% delle cellule T circolanti al giorno 28. Questo è coinciso con l'eliminazione delle cellule B circolanti, che erano quasi non rilevabili al giorno 28 mediante citometria a flusso. Le cellule haplo-TanCAR-T 19/22 erano ancora misurabili con un livello basso del 2,29% delle cellule T circolanti e le cellule B circolanti non si erano ancora riprese al momento della stesura di questo rapporto. Le cellule haplo-TanCAR-T 19/22 erano presenti anche mediante citometria a flusso in tutti i punti temporali di valutazione della risposta nel BM ottenuto durante la valutazione della risposta, e l'aplasia cronica delle cellule B è stata documentata. È stata osservata una concordanza complessiva tra l'espansione e la persistenza delle cellule haplo-TanCAR-T 19/22 nel PB misurato mediante citometria a flusso e qPCR. Al momento della stesura di questo rapporto, il DNA di TanCAR-19/22 rimaneva rilevabile mediante qPCR con 1134 e 396 copie per microgrammo di DNA nel PB e nel BM, rispettivamente. Dopo l'infusione di cellule haplo-TanCAR-T 19/22, il paziente ha manifestato un CRS di grado 3, classificato secondo la scala di UPenn ([]). La febbre, che ha raggiunto i 38,8 °C entro 24 ore dall'infusione di cellule haplo-TanCAR-T 19/22, è durata 11 giorni ed è diventata afebrile il giorno 12 dopo il trattamento con una dose inferiore di tocilizumab a 160 mg (1,6 mg/kg) ed etanercept 50 mg il giorno 8. Le citochine sieriche sono aumentate notevolmente 7 giorni dopo l'infusione e sono tornate quasi ai valori basali il giorno 41, quando i livelli di interleuchina (IL)-6 hanno raggiunto il picco a 3377 pg/mL (88 volte rispetto al valore basale) il giorno 11. L'aspartato aminotransferasi e la lattato deidrogenasi sono aumentate significativamente da 8 a 10 giorni dopo l'infusione, raggiungendo il picco a 1529,1 U/L (38 volte rispetto al valore basale) e 2027,8 U/L (13 volte rispetto al valore basale) il giorno 12, e sono tornate ai valori basali il giorno 21 con il miglior supporto. Il paziente ha anche manifestato una disfunzione della coagulazione con un tempo di tromboplastina parziale attivata prolungato, elevati livelli di D-dimeri e ridotta concentrazione di fibrinogeno, nonché una permeabilità capillare con ipoalbuminemia di grado 2 nonostante un'intensa supplementazione di proteine durante il CRS, che si è risolta entro il giorno 23. La GVHD acuta della pelle di stadio 3, che era sotto controllo, si è riattivata e ha rapidamente progredito fino alla GVHD della pelle di stadio 4 con nuove ulcerazioni cutanee locali, in particolare nella pelle dello scroto e nella mucosa orale, 11 giorni dopo l'infusione di cellule haplo-TanCAR-T 19/22. La concentrazione di bilirubina totale nel siero è aumentata costantemente dal giorno 12 e ha raggiunto 134 μmol/L il giorno 21. Data la rapida progressione delle manifestazioni della GVHD della pelle e il coinvolgimento del fegato, è stata somministrata una dose più bassa di metilprednisolone a 20 mg al giorno come dose iniziale, con successivo ridimensionamento nel tentativo di bilanciare i benefici e i rischi dell'immunosoppressione sistemica, dal giorno 21 e interrotta dal giorno 39. L'eruzione cutanea e la bilirubina totale nel siero sono migliorate significativamente dopo questi trattamenti. Tuttavia, le manifestazioni della GVHD intestinale di stadio 3, che comprendevano principalmente diarrea, si sono verificate dal giorno 50, e la bilirubina totale nel siero è aumentata di nuovo, suggerendo una GVHD acuta di grado 3. Dal giorno 78 sono state somministrate 16 dosi di metilprednisolone 20 mg al giorno, controllando significativamente la diarrea e la bilirubina totale nel siero. Questo paziente ha successivamente mostrato una GVHD cronica moderata, che si è manifestata principalmente come sclerodermia, diarrea e perdita di peso. La trombocitopenia persistente con conta piastrinica compresa tra 15 × 109 e 43 × 109/L senza trasfusione di piastrine poteva essere riconosciuta come una manifestazione di GVHD cronica nel contesto della ricostituzione della normale emopoiesi. Il trattamento immunosoppressivo sistemico è stato ridotto entro 2 mesi con metilprednisolone 4 mg a giorni alterni e metotrexato 5 mg una volta alla settimana e sirolimus 1 mg al giorno come dose minima di mantenimento dal giorno 154 fino al momento della stesura di questo rapporto, mantenendo la GVHD cronica sotto buon controllo.