Una donna di 47 anni (peso: 62 kg) è stata diagnosticata con epatite B cronica attiva HBeAg-positiva nel 1996. Parametri virali come HBeAg, antiHBe IgG e carica virale plasmatica HBV da campioni congelati sono stati misurati simultaneamente da un unico operatore per ridurre le variazioni intra e inter-analisi. HBeAg e anti-HBe sono stati determinati mediante elettro-chemiluminescenza (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). I livelli di carica virale HBV sono stati determinati mediante PCR in tempo reale (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, range dinamico da 30 IU/ml a 110.000.000 IU/ml) []. L'infiammazione del fegato è stata misurata mediante livelli di alanina aminotransferasi (ALT) sierici. Per l'analisi della sequenza, i geni preC-core e HBV pol sono stati sequenziati in sequenza con i primer come descritto in precedenza []. L'analisi è stata eseguita utilizzando uno strumento ABI3100 (Applied Biosystems), e le sequenze introdotte in questo lavoro, nonché quelle ottenute dal database GenBank, sono state allineate con ClustalX v1.83 [] e modificate con Bioedit v7.0.9.0 [] Il genotipo HBV è stato valutato mediante inferenza filogenetica utilizzando l'algoritmo Neighbor-joining con il modello di evoluzione molecolare Kimura-two-parameter nel software MEGA v3.1 [] Le sequenze di entrambi i geni sono state ottenute in diversi momenti durante la terapia antivirale. Un'analisi clonale più dettagliata del gene pol HBV è stata condotta su sette isolati virali selezionati da campioni di siero raccolti durante le terapie sequenziali. Ciascun prodotto PCR selezionato del gene pol è stato clonato nel vettore pGEM-T Easy secondo le istruzioni del produttore (Promega, Wisconsin, USA) e almeno 15 cloni sono stati ulteriormente analizzati mediante sequenziamento. Ciò ha permesso di analizzare l'evoluzione delle quasi-specie virali sotto le successive pressioni antivirali basate sull'analisi del gene pol. Le terapie anti-HBV, accompagnate dalla carica virale HBV e dalla cinetica del livello ALT, sono illustrate nella figura. La terapia è stata iniziata quando la carica virale HBV è aumentata a 6,5 × 106 IU/ml. Nel 1998, quando il paziente è stato trattato con IFN-alfa 5 MU tre volte alla settimana per 30 settimane, il livello di DNA HBV era inferiore al limite di rilevamento. Questa terapia è stata interrotta e sostituita nel 1999 con la lamivudina (150 mg una volta al giorno). Dopo 2 anni di trattamento continuo, il DNA HBV era rilevabile (15,5 × 106 IU/ml). HBeAg è rimasto negativo con anti-HBe rilevabile durante questo periodo di trattamento. Nel 2001, dopo una sospensione di 6 mesi, il livello di DNA HBV ha evidenziato un flare post-trattamento (1 × 108 IU/ml). Alla fine del 2003 la terapia con lamivudina è stata reintrodotta (150 mg una volta al giorno). È stata accompagnata da un evento raro di inversione a un profilo HBeAg positivo/anti-HBe negativo, che è rimasto rilevabile per due anni. La carica virale ha raggiunto 3,1 × 106 IU/ml a questo punto. Dieci mesi dopo, nel 2006, il regime di lamivudina è stato sostituito da adefovir monoterapia (10 mg/giorno). Inizialmente, i livelli di carica virale erano bassi (8.5 × 104 IU/ml) ma dopo 48 settimane di terapia questi livelli hanno raggiunto 7.15 × 106 IU/ml. I livelli di ALT erano normali durante questo intervallo. La riattivazione della replicazione di HBV è stata ipotizzata considerando la contemporanea rilevazione di HBeAg/anti-HBe [] e l'elevata replicazione rilevata. La presenza di HBeAg e anti-HBe non sembra essere rara tra i pazienti naïve al trattamento antivirale, ma la sua prevalenza in pazienti con esperienza di terapia è sconosciuta. Questo modello sierologico è stato correlato a un danno epatocitario esteso e a una grave lesione epatica immuno-mediata e conseguente disfunzione [] Sei mesi dopo, il livello di ALT è leggermente aumentato (1.5 × limite superiore normale - UNL -) e la monoterapia con entecavir è stata istituita (1 mg al giorno). Dopo 5 mesi di monoterapia con entecavir, tenofovir (300 mg una volta al giorno) è stato aggiunto al regime terapeutico per la duplice terapia. Il DNA dell'HBV è diminuito a 1 × 105 IU/ml per quattro mesi, ma tre mesi dopo la carica virale ha raggiunto > 1.1 × 108 IU/ml. Inoltre, un aumento del livello di ALT (20× UNL) ha indicato un'infiammazione del fegato. Durante le successive 48 settimane, la replicazione virale è leggermente diminuita a 6.1 × 106 IU/ml, ma è poi ripresa prima a 3.6 × 107 IU/ml e poi a > 1.1 × 108 IU/ml. Più recentemente (secondo semestre 2010), i livelli di DNA dell'HBV sono variati tra 4.3 × 104 IU/ml e 4.9 × 107 IU/ml. Alla fine del follow-up dello studio, siamo stati in grado di misurare la concentrazione di tenofovir nel plasma mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni in tre campioni consecutivi 20 ore dopo la somministrazione, raggiungendo 71.6 ng/ml ± 47.6 (media ± SD). I livelli ALT-AST sono rimasti leggermente elevati (2× UNL) durante gli ultimi due anni di follow-up. Gli isolati HBV del paziente sono stati attribuiti al genotipo A2 sulla base della somiglianza filogenetica tra le sequenze genomiche parziali HBV dei geni pol e preC-C. Un'ulteriore analisi genotipica longitudinale, compresa la composizione di quasispecie dei ceppi HBV isolati dal paziente, ha rivelato la presenza di mutazioni di resistenza basate sulle sequenze geniche pol (Tabella). All'inizio del trattamento con lamivudina, il HBV era di tipo selvaggio in tutti i cloni. Dopo 2 anni di tale terapia, questa popolazione virale è stata completamente sostituita dalla mutazione rtM204I - che mostrava omogeneamente la resistenza alla lamivudina. Quando tale terapia è stata interrotta per 6 mesi, la composizione di quasispecie consisteva quasi esclusivamente in sequenze nucleotidiche pol di tipo selvaggio, ad eccezione di un contributo minore (< 10%) che mostrava la mutazione I233V associata alla resistenza ad adefovir. Una volta reintrodotta la terapia con lamivudina, e fino a quando non sono stati somministrati entecavir più tenofovir, le doppie mutazioni rtL180M e rtM204I associate alla resistenza alla lamivudina sono state rilevate invariabilmente. Nell'ambito di quest'ultimo schema terapeutico, solo in modo effimero e con un contributo minore (~5%), sono state rilevate le mutazioni A181T e T184L associate alla resistenza alla lamivudina e ad adefovir, rispettivamente. Inoltre, sono state rilevate altre due varianti nel dominio catalitico della trascrittasi inversa al momento della resistenza alla lamivudina. Tali varianti rtA200V e rtI253V sono rimaste presenti durante la terapia con entecavir e sono state rilevate anche nei campioni sequenziati dopo la comparsa di resistenza durante la terapia con entecavir. La caratterizzazione genomica dell'HBV a livello preC-C ha mostrato la presenza della doppia mutazione A1762T e G1764A, che è stata rilevata precocemente quando il paziente non era sottoposto a trattamento, restando in questa condizione durante l'intero follow-up. La mutazione T1753C è stata anche costantemente rilevata. La presenza di queste mutazioni del promotore principale è anche correlata al profilo concorrente HBeAg-antiHBe di cui sopra, riscontrato in questo paziente, come recentemente riportato [].